中国公共卫生  2014, Vol. 30 Issue (5): 630-631   PDF    
引用本文
李舒音, 余秋颖, 符文双, 张威, 刘健. 新型淋巴细胞培养基配制及其性能比较评价[J]. 中国公共卫生, 2014, 30(5): 630-631.
LI Shu-yin, YU Qiu-ying, FU Wen-shuang, et al. Preparation and performance evaluation of a new culture medium for lymphocyte[J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(5): 630-631.
新型淋巴细胞培养基配制及其性能比较评价
李舒音, 余秋颖, 符文双, 张威, 刘健    
沈阳医学院, 辽宁 沈阳 110034
数字出版日期：2014-4-8 10:55
基金项目：辽宁省科学技术计划项目（2011408004）
作者简介：李舒音（1966-），女，辽宁沈阳人，教授，硕士，主要从事细胞生物学研究工作。
摘要：目的 比较大鼠淋巴细胞在不同培养基中的生长及增值状况，筛选最佳新型淋巴细胞培养基。方法 分离培养大鼠胸腺淋巴细胞，分别采用新配方培养基、无血清RPMI-1640培养基和无血清新配方培养基培养细胞，用倒置显微镜观察细胞的生长状态，MTT 比色法检测细胞增殖活性。结果 镜下观察，接种24 h后不同培养基中细胞均匀大量贴壁并伸展，5 d细胞生长数量减少，出现衰退；含0.1 mmol的蛋氨酸脑非肽（MEK）的新型淋巴细胞基可大幅度提高淋巴细胞生长，细胞生长状态良好，新型培养基中淋巴细胞增殖活性与传统RPMI-1640比较差异均有统计学意义（P<0.05）；在RPMI1640培养基、新配方2培养和无血清新配方2培养基中淋巴细胞增殖活性分别为99.9%、103.1%和96.6%。结论 新型培养基较 RPMI-1640 更适合淋巴细胞生长及增殖。
关键词： 胸腺淋巴细胞     细胞培养     新型培养基     无血清新型培养基    
Preparation and performance evaluation of a new culture medium for lymphocyte
LI Shu-yin, YU Qiu-ying, FU Wen-shuang, et al    
Shenyang Medical College, Shenyang, Liaoning Province 110034, China
Abstract: Objective To compare the growth and proliferative status of rat lymphocytes in different media, and to screen the new medium for lymphocyte culture.Methods Isolated and cultured rat thymus lymphocytes were cultured in a new medium, serum-free RPMI-1640 medium and a new serum-free medium.The growth states of the cells were observed with inverted microscope.The cell proliferative activity was detected by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)colorimetric assay.Results Twenty-four hours after the inoculation, a large number of cells in different media adhered to the wall and spread evenly.Five days after the inoculation the number of cell growth was reduced, and the cells were declined.The new medium containing 0.1 mmol of methionine-enkephalin(MEK)could improve lymphocyte cell growth greatly.There was a significant difference in the cell proliferative activity between the new medium and traditional RPMI-1640 medium(P<0.05).The lymphocyte proliferation activity in RPMI-1640, the new medium(formulation 2)with serum, and the serum-free new medium(formulation 2)was 99.9%, 103.1%, and 96.6%, respectively.Conclusion The new medium prepared is more suitable for the growth and proliferation of rat lymphocyte.
Key words: thymus lymphocyte     cell culture     new medium     serum-free new medium    

传统淋巴细胞培养采用的培养基多系人工合成的培养基加小牛(或胎牛)血清组成。由于小牛血清成分复杂,有效期短,易污染,来源较困难,研究者不断改良培养基成分或用“无血清培养”进行细胞培养的试验研究[1],但至今尚未形成统一、稳定、易于接受的培养基供科研和医学临床推广应用。本研究用蛋氨酸脑啡肽(methionine-enkephalin,MEK)代替传统配方中谷氨酰胺，对大鼠胸腺淋巴细胞培养，并比较不同培养基细胞增值活性及评价新配方培养基的性能，为进一步研究人淋巴细胞培养基提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 试剂与材料

RPMI1640(美国GIBCO公司)；胎牛血清(美GIBCO公司)；L-谷氨酰胺(北京鼎国生物技术有限公司)；淋巴细胞分离液(上海拜沃生物科技有限公司)；MEK(美Penta Biotech Inc．公司，批号0711200)；3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-二苯基溴化〔3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT；美国Sigma公司〕。昆明种小鼠(8周龄)由沈阳医学院实验动物研究中心提供(沈医动物质量合格证号：0008180)。 1.2 方法 1.2.1 新型培养基的配制

将RPMI 1 640中谷氨酰胺用蛋氨酸脑啡肽替换(含蛋氨酸脑啡肽(MEK)浓度分别为0.05、0.1、0.2 mmol/L)组成3组新培养基(分别为新配方1、新配方2、新配方3)；无血清新配方中胎牛血清用双蒸水15 mL代替(含MEK浓度分别为0.05、0.1、0.2 mmol/L)3组配方分别为：无血新配方1、无血新配方2、无血新配方3。各种培养基均按常规方法配制,以NaHCO3调pH 至(7.4 ±0.1)。 1.2.2 淋巴细胞培养、观察与收获

参照文献[2]无菌取小鼠(8周龄)胸腺，制成淋巴细胞悬液，调整细胞密度为103/m。将40个培养瓶分别加入已配制的各种培养基，共分为RPMI1640完全培养基组；新配方培养基3组；无血清RPMI1640组；无血清新配方培养基3组；每组5个培养瓶。将淋巴细胞悬液加入各培养瓶中，每瓶调整细胞数为2.0×103/mL，37 ℃ 5％CO2饱和湿度培养箱中培养5 d。48 h更换培养基一次。胸腺淋巴细胞培养6 h在显微镜下进行第一次观察，以后每间隔12 h观察一次。细胞生长至第3 d进行第1次收获，每个培养瓶6～7 mL细胞悬液、计数、冷冻保存备用，余下每瓶3～4 mL细胞悬液，调整细胞数为2.0×103/mL在同样条件下继续培养至第5 d，并进行第2次收获计数分析淋巴细胞生长数。 1.2.3 MTT法检测淋巴细胞增殖

取大鼠眼内眦静脉血，制备淋巴细胞悬液，台盼蓝拒染法检测活细胞数>95%。用新配方2培养基和无血新配方2调整T淋巴细胞浓度为1×108/L，将细胞接种于24孔板内，每孔1 mL。各组样本数均为5孔。分别取培养72 h的细胞 100 μL(1×108/L)接种于96孔培养板中，每孔加入MTT工作液20 μL，37 ℃孵育4 h后，分别加入二甲基亚砜100 μL，轻轻振荡10 min，静置20 min，待结晶完全溶解后，于酶标仪上以570 nm波长测定各组的吸光度值(A值)。以RPMI 1640培养基为对照孔求出对照组均值(Am)，计算各组增殖率(R=A/Am×100%)，评价各组T淋巴细胞增殖活性[3]。 1.3 统计分析

应用SPSS 13.0软件包对实验结果进行统计学分析，两样本均数的比较采用t检验，检验水准为α=0.05。 2 结 果 2.1 胸腺淋巴细胞在不同培养基中细胞生长情况(表 1)

胸腺淋巴细胞在不同培养基中培养至第3 d时，细胞数均有增加，但在不同培养基中收获的 细胞数不同，新配方2培养基和无血新配方2培养基中细胞生长数与RPMII640组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 不同培养基胸腺淋巴细胞培养细胞生长数(个/mL)
2.2 4种培养基中淋巴细胞增殖活性

4种培养液淋巴细胞增殖活性相似，RPMI1640培养基增值率为99.9%；新配方2培养基为103.1%；无血清RPMII640培养基为95.4%；无血清新配方2培养基为96.6%，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。 3 讨 论

谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主要能源，缺乏时可导致细胞生长不良甚至死亡[4]。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4 ℃下放置7 d即可分解约50%，配制好含谷氨酰胺的培养基在4 ℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，这为实验增添了很大麻烦。蛋氨酸脑啡肽(MEK)是一种短肽因子，具有免疫调控和细胞增殖调控作用 [5]。MEK作为培养基的一种辅助成分刺激淋巴细胞活性明显增高的作用，能够在培养基中对淋巴细胞的生长产生巨大的刺激作用，并对细胞本身无任何毒副作用[6]。本实验显示：新配方2培养基和无血清新配方2培养基与 RPMI1640培养基细胞生长效果相似，其中含0.1 mmol的MEK的培养基可大幅度提高淋巴细胞生长数。用含0.1 mmol MEK的新配方2培养基对淋巴细胞增值活性指标检测[7]，与RPMI1640培养基相比较效果更佳(P＞0.05)，表明“新型培养液”完全可以替代传统培养液用于外周血淋巴细胞染色体制备。本实验在无血清培养液中加入MEK代替了谷氨酰胺增加了培养液的稳定性，其作用机理及胸腺淋巴细胞是否以MEK为能源的细胞，有待于下一步进行研究。

参考文献
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