血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性卒中、出血性卒中造成脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。发病原因主要与反复性脑缺血再灌注有关^[1]，发病机制尚不十分明确，缺少特效治疗药物。中医药在长期的临床实践中，根据辩证施治特点，总结出许多对VD有效的单方、复方。其中活血益智片(由石菖蒲、黄芪等组成)具有益气活血，宁神益智的功效，对脑缺血损伤有神经保护作用^[2]。本研究通过观察活血益智片对VD模型大鼠脑组织中一氧化氮(nitric oxide NO)、5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)含量及N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)表达影响，探讨活血益智片对血管性痴呆的保护作用及机制。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

SPF级雄性Wistar大鼠60只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，许可证号：SCXK(京)2005－0009，体重(250±30)g；活血益智片(批号:091210，辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心)由黄芪、山楂、葛根、川芎、石菖蒲组成，含1.15 g 生药/片；甲磺酸二氢麦角毒碱片(喜得镇)(批号：9H849T，天津华津制药厂)；硝普纳粉针剂(批号：080502，武汉人福药业有限责任公司)。NO测试盒(南京建成生物工程研究所)；5-HT标准品(美国Sigma公司)，NMDA受体免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；MT-200Morris 水迷宫视频分析系统(成都泰盟科技有限公司)；6410 TripleQuad LC/MS(美国Agilent公司)。 1.2 模型制备

大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg,腹腔注射麻醉，仰卧位手术台固定大鼠，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉(CCA)，硝普钠2.5 mg/kg腹腔注射，随即无创动脉夹夹闭双侧CCA 10 min后，再通10 min，再夹闭10 min。再通后缝合伤口并涂抹青霉素。假手术组分离但不阻断CCA，不注射硝普钠。所有大鼠在相同条件下饲养，自由饮食饮水。在全部造模过程中保持动物肛温37 ℃左右。术后每只大鼠肌注青霉素0.2万U，连续3 d。 1.3 分组与处理

手术第7天，将造模后存活大鼠60 只按体重随机分为6组，每组10只，分别为假手术组、模型组、活血益智片低、中、高剂量(1.55、3.1、6.2 g/kg)组、喜得镇(5.4 mg/kg)组，灌胃给药，灌胃容积10 mL/kg，每日1次，假手术组及模型组给予同体积蒸馏水，连续给药28 d。 1.4 指标与方法 1.4.1 行为学检测

采用Morriss 水迷宫法，水温23~25 ℃，水中加入牛奶，在固定象限设有安全台，液面高于安全台2 cm，各组大鼠进行定位航行实验，连续5 d，测定其逃避潜伏时间(s)，第5 d结束后，除去安全台，进行空间探索实验，测定其在有效区停留时间、距离及穿越安全台次数，评价其学习记忆能力。 1.4.2 脑组织中5-HT和NO含量测定

末次给药后1 h，处死大鼠，冰盘上迅速取右侧大脑，用冰冷生理盐水漂洗除去积血后，称重，按每克3 mL比例加入预冷蒸馏水，匀浆6~8 min，于12 000 r/min(-4 ℃)离心 10 min，精密吸取上清液 0.5 mL，加入乙腈 0.5 mL，涡旋混匀 1 min，于10 000 r/min离心10 min，取15 μL 注入液质联用仪测定5-HT含量。色谱条件为流动相：甲醇-水(50∶50)，流速：0.5 mL/min，C₁₈(4.6 mm×150 mm，5 μm)。正离子 MRM 模式，mz177/115 碰撞能 30 eV；取左侧大脑加9倍重量的生理盐水匀浆，3 500 r/min离心10 min，取匀浆上清制备成10%组织匀浆，硝酸还原酶法测定NO含量，考马斯亮兰法进行蛋白定量。 1.4.3 大鼠脑组织中NMDAR表达

采用免疫组织化学法，行为学实验结束后，麻醉大鼠，立即开胸暴露心脏，左心室迅速插管到主动脉处，同时剪开右心房，快速灌注生理盐水，待肝脏变白后，改灌4%多聚甲醛(pH 7.4)500 mL，速度先快后慢；至大鼠四肢僵硬为度，冰上取脑；再将脑置于4%多聚甲醛中浸置24 h(4 ℃)，取脑组织，连续切片(5 μm)，进行免疫组化染色，观察NMDAR表达。 1.5 统计分析

实验数据以(x±s)表示，应用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，采用t检验进行组间差异比较。P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 活血益智片对大鼠学习记忆能力影响(表 1)

与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.01)；与模型组比较，活血益智片各组大鼠逃避潜伏期均明显缩短(P＜0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠通过安全台次数减少、有效区停留时间和距离显著缩短(P<0.01)；与模型组比较，活血益智片高、中剂量组大鼠通过安全台次数增加、有效区停留时间和距离延长(P<0.05)。

表 1

表 1 活血益智片对 VD 大鼠空间探索成绩的影响(x±s，n=10) 组别(g/kg) 潜伏期(s) 通过安全台次数(次) 有效区停留时间(s) 有效区停留距离(m) 假手术组 15.97±11.61 2.91±1.31 3.60±1.39 45.59±16.91 模型组 34.11±13.58a 1.20±1.03a 1.86±0.95a 25.10±14.57a 活血益智片组 6.20 15.18±6.82b 3.60±1.26b 4.38±1.43b 56.13±22.08b                          3.10 19.24±11.45c 2.70±1.20b 3.02±1.38c 42.79±18.95c                          1.55 22.62±10.04c 2.00±0.67 2.80±1.02 34.82±17.23 喜得镇组(5.40 mg/kg) 19.92±12.51c 2.60±1.51c 3.06±1.43c 38.76±12.99c 注：与假手术组比较，a P<0.01；与模型组比较，b P<0.01，c P<0.05。

表 1 活血益智片对 VD 大鼠空间探索成绩的影响(x±s，n=10)

与假手术组比较，模型组大鼠脑内5-HT含量下降、NO 含量升高(P<0.05)；与模型组比较，活血益智片高、中、低剂量组大鼠脑中5-HT 含量明显升高、NO含量明显下降(P<0.05)。

表 2

表 2 活血益智片对 VD 大鼠脑组织中 5-HT 、NO含量影响(x±s，n=10) 组别(g/kg) 5-HT 含量(ng/g) NO 含量(μmol/gprot) 假手术组 29.91±3.49 87.63±38.98 模型组 20.26±0.57a 132.61±33.99b 活血益智片组 6.20 26.23±3.08c 95.57±29.06d                          3.10 25.34±2.11c 97.73±37.44d                          1.55 22.21±0.98c 100.38±32.95d 喜得镇组(5.40 mg/kg) 27.94±5.48c 98.65±20.65d 注：与假手术组比较，a P<0.01，b P<0.05；与模型组比较，c P<0.01，d P<0.05。

表 2 活血益智片对 VD 大鼠脑组织中 5-HT 、NO含量影响(x±s，n=10)

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中NMDAR表达明显增加，呈深棕黄色，并可见胞核着色；与模型组比较，活血益智片高、中剂量组和喜得镇组大鼠脑组织中NMDAR阳性神经元表达明显减少，且染色淡黄，只见到部分神经元着色。

图 1

图 1 活血益智片对VD模型大鼠NMDAR表达影响(免疫组化染色,×40)

本研究选择反复缺血-再灌注同时腹腔注射硝普钠法制作VD模型，使大鼠产生脑血流量降低及认知功能障碍，该模型符合VD的发病特点，并具有一定的结构效度 ^{[3, 4]}。Morris水迷宫是一种经典的检测动物空间位置觉和方向觉的学习、记忆能力方法，具有可提供详细数据、全面客观等优点^{[5, 6]}。本研究结果显示，模型组大鼠的学习和记忆能力明显障碍，认知能力显著下降；而活血益智片可改善VD大鼠记忆、学习能力，表现为缩短逃避潜伏期、延长有效区停留距离和时间及增加穿越平台次数。

NO在体内是以左旋精氨酸为底物，经一氧化氮合酶(NOS)催化而成，具有生理及病理双重作用。在正常生理情况下催化产生的NO在学习记忆机制中具有重要作用。脑缺血缺氧后，NO含量显著增加，过量的NO具有强神经细胞毒性作用，可引起神经损伤^{[7, 8]}。单胺类神经递质是记忆形成和保持的重要物质，脑缺血缺氧时，突触体对5-HT再摄取障碍，致使脑组织中5-HT含量下降^{[9, 10]}。本研究结果显示，模型组大鼠脑内NO含量明显升高，5-HT含量明显下降；活血益智片干预后NO含量有所下降，5-HT 含量明显增加。NMDAR是一种特殊的离子通道蛋白，在缺血缺氧等病理情况下，催化产生NO，介导兴奋性毒性作用，导致神经元损伤甚至学习记忆缺陷^[11]。本研究结果表明，活血益智片各组大鼠脑组织中NMDAR表达减少。提示，活血益智片可改善VD模型大鼠的学习记忆能力，其机制可能与减少大鼠脑组织中NO含量、增加5-HT含量，并且减少NMDAR的表达有关。