有关统计数据表明,中国每年新增宫颈癌患者约10万例，而且伴有扩大趋势，其90％～95％发病与人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染相关^[1]，HPV亚型依据致病力大小或肿瘤发生的危险性高低不同可分为低危型和高危型,及时快速地检测出HPV病毒基因型，对治疗、预防及观察这类病毒引起的疾病有重要意义，并且对不同地区的高发亚型研发相应的疫苗有积极的指导作用。本研究对2011年7月—2012年3月在江苏省各城市医院门诊就诊女性HPV 23个亚型检测结果进行分析，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 样本

来自2011年7月—2012年3月在江苏南京、苏州、无锡、常州、扬州等9个城市医院门诊就诊的4 590例女性患者宫颈脱落细胞标本。对象年龄为18~80岁，平均年龄为(32.3±9.5)岁。纳入标准：取样时不在月经期，取样前3 d内无阴道给药史，24 h无性生活。采样采用专用宫颈刷，样本置无菌带盖试管，冰壶密闭运输，2~8 ℃保存，2 d内检测结束。 1.2 试剂与仪器

HPV基因分型检测试剂(深圳亚能生物技术有限公司)，18种高危亚型为HPV16、18、31、33、 35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4，5种低危亚型为HPV6、11、42、43、44；PCR扩增仪为LIFE EXPRESS(上海京工实业有限公司)；Combi-H12型分子杂交仪(韩国Finepcr)。 1.3 实验方法

(1)HPV DNA抽提：充分洗脱宫颈刷上的样本，将洗脱液转移至1.5 mL离心管中，13 000 r/min离心10 min，弃上清，再加入50 μL裂解液，漩涡混匀器上充分震荡，使管底沉淀物与裂解液彻底混匀。100 ℃干浴10 min(误差不超过±1 min)。然后13 000 r/min离心10 min，保留上清备用。(2)基因扩增：取上清5 μL加入扩增反应管中，反应总体积25 μL。扩增条件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃ 5 min。(3)杂交洗膜显色：15 mL离心管中，加入A液(含10%十二烷基硫酸钠10 mL的20x SSC 100 mL稀释至1 000 mL)(注：20x SSC是175.3 g氯化钠、88.2 g柠檬酸钠加蒸馏水800 mL用浓盐酸调pH 7.0，最终定容至1 000 mL)5 mL及相应的PCR扩增产物，将盖拧紧，颠倒3~5次混匀PCR产物。再将管盖稍拧松，以免加热时管盖爆开。将离心管放入沸水浴中加热10 min，确保管内杂交液液面完全位于沸水浴液面下。取出离心管，拧紧盖子，放入杂交箱51 ℃杂交2 h。取50 mL离心管，每管加入40 mL B液(含10%十二烷基硫酸钠10 mL的20x SSC 25 mL稀释至1 000mL)。拧紧管盖，放入杂交箱51 ℃预热2 h。取出杂交好的膜条，快速转移至装有预热B液的50 mL离心管中，每4张膜条放入1个50 mL离心管中。将装有膜条的离心管放入51 ℃杂交箱中，摇动洗涤5 min。按要求显色，检测HPV 23个亚型。 1.4 统计分析

采用SAS 9.12软件进行分析，多组率的比较采用χ²检验。置信水准α=0.05，所有检验为双侧检验。 2 结 果 2.1 门诊参检女性HPV亚型总体情况

参检人数为4 590人，共进行23种HPV亚型检测，检出21种亚型，总感染率(感染亚型≥1种)为38.71%(1 777/4 590)。低危型中HPV11检出率最高，为8.1%(372/4 590)，其他依次HPV33为6.88%(316/4 590)，HPV6为5.69%(261/4 590)，HPV42为3.41%(157/4 590)、HPV44为3.11%(143/4 590)；高危型中检出率最高的是HPV59，为6.49%(298/4 590)，其他依次HPV56为5.42%(249/4 590)，HPV51为4.64%(213/4 590)，检出率最低的是MM4 和HPV35，仅分别检出2和1例。 2.2 不同城市门诊参检女性HPV亚型检出率比较(表 1)

9所城市门诊就诊病例HPV6、HPV11、 HPV31、HPV33、HPV59、HPV73亚型检出率差异有统计学意义(均P<0.05)。南通市HPV59阳性检出率最高，扬州市HPV11阳性检出率最高，苏州市HPV6阳性检出率最高，无锡市HPV73阳性检出率最高。

表 1

表 1 门诊参检女性HPV亚型检出率比较不同地区 地区 例数 HPV6 HPV11 HPV31 HPV33 HPV59 HPV73 例 % 例 % 例 % 例 % 例 % 例 % 南通 131 6 4.58 10 7.63 3 2.29 10 7.63 15 11.45 0 0.00 扬州 156 9 5.77 21 13.46 0 0.00 11 7.05 12 7.69 2 1.28 苏州 936 80 8.55 87 9.29 28 2.99 93 9.94 96 10.26 6 0.64 无锡 436 37 8.49 49 11.24 13 2.98 27 6.19 40 9.17 10 2.29 镇江 138 2 1.45 13 9.42 3 2.17 6 4.35 8 5.80 0 0.00 常州 226 15 6.64 17 7.52 6 2.65 20 8.85 6 2.65 1 0.44 泰州 152 2 1.32 13 8.55 5 3.29 11 7.24 3 1.97 1 0.66 宿迁 203 15 7.39 16 7.88 1 0.49 10 4.93 11 5.42 1 0.49 南京 2 180 93 4.27 144 6.61 22 1.01 125 5.73 104 4.77 4 0.18 χ2值 40.96 20.78 27.14 22.84 54.86 36.63 P值 <0.001 0.014 0.001 0.007 <0.001 <0.001

表 1 门诊参检女性HPV亚型检出率比较不同地区

9种HPV亚型年龄分布差异均有统计学意义(均P<0.05)。≤25、26~30岁年龄组感染阳性率最高的HPV亚型均为HPV59，31~39、≥40岁年龄组感染阳性率最高的HPV亚型均为HPV11。

表 2

表 2 参检女性不同HPV亚型年龄分布 HPV亚型 例数 ≤25 26~30 31~39 ≥40 χ2值 P值 例 检出率(%) 例 检出率(%) 例 检出率(%) 例 检出率(%) HPV6 236 115 9.29 53 5.73 28 3.05 40 3.96 46.73 <0.001 HPV11 328 104 8.40 52 5.62 73 7.96 99 9.80 11.81 0.008 HPV43 157 33 2.67 14 1.51 90 0.98 20 1.98 8.98 0.030 HPV31 70 30 2.42 9 0.97 18 1.96 13 1.29 8.15 0.043 HPV33 286 110 8.89 53 5.73 53 5.78 70 6.93 11.17 0.011 HPV51 189 57 4.60 29 3.14 42 4.58 61 6.04 9.25 0.026 HPV58 70 28 2.29 20 2.16 6 0.65 16 1.58 16.10 <0.001 HPV59 271 130 10.50 58 6.27 38 4.14 45 4.46 47.06 <0.001 HPV66 116 60 4.85 16 1.73 14 1.53 26 2.57 28.22 <0.001

表 2 参检女性不同HPV亚型年龄分布

除单一感染外，其他各种类型感染不同地区间差异均有统计学意义(均P<0.001)，其中以苏锡常地区女性感染率最高。各种类型感染不同年龄间差异均有统计学意义(均P<0.05)，总感染率≤25岁女性最高。

表 3

表 3 不同地区与年龄参检女性HPV亚型组合感染检出率比较 HPV亚型 例数 总感染a 单一感染b 合并低危亚型c 合并高危亚型a 混合感染a 例 % 例 % 例 % 例 % 例 % 地区     南京 2 180 753 34.54 508 23.30 43 1.97 133 6.10 245 11.24     苏锡常 1 598 725 45.37 425 26.60 85 5.32 186 11.64 300 18.77     其他地区 812 326 40.15 169 20.86 19 2.34 63 7.76 116 14.29     χ2值 45.61 5.83 35.68 37.48 42.48     P值 <0.001 0.054 <0.001 <0.001 <0.001 年龄(岁)     ≤25 1 238 536 43.30 285 23.02 58 4.68 147 11.87 257 20.77     26～30 925 321 34.70 204 22.05 27 2.92 65 7.03 117 12.65     31～39 917 333 36.31 231 25.19 18 1.96 64 6.97 102 11.12     ≥40 1 010 425 42.08 296 29.31 30 2.97 75 7.43 129 12.77     χ2值 23.08 16.89 13.51 21.16 46.27     P值 <0.001 <0.001 0.004 <0.001 <0.001 注：a：感染任一种亚型；b：只单独感染一种亚型；c：感染低危亚型≥2种；d：感染高危亚型≥2种；e：感染HPV亚型≥2种。

表 3 不同地区与年龄参检女性HPV亚型组合感染检出率比较

宫颈癌是全球妇女第二大常见恶性肿瘤，HPV持续感染是导致宫颈癌的主要因素，通过HPV-DNA检测可以进行早期诊断和预防^[2]。有研究表明，HPV有200多个亚型，约35个亚型与生殖道感染有关，其中20 个亚型与癌症相关，与宫颈癌相关的高危型HPV多达13种^[3]。高危型HPV感染与宫颈癌的发生密切相关，临床研究表明，99.7%宫颈癌患者存在HPV感染，因此，早期筛查有助于该疾病的及早治疗，同时这种明确的病因学关系促进了HPV疫苗的快速发展^{[4, 5]}。

HPV感染率和基因型别存在明显的地区差异。研究报道，在中国多个地区HPV感染率分别为北京57.1%、山西27.5%、深圳17.5%、福州31.33%、杭州25.9%、深圳20.1%、天津29.20%、西安23.56%、呼和浩特13.04%、河北45%^{[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]}。就基因型而言，在世界范围内，国际癌症研究所研究表明，HPV16、18、31、52、58型占所有HPV感染的50%，其中最常见的是HPV16^[14]。在亚洲国家HPV52、58型感染率明显高于HPV31、33型；在中国HPV16、18、31、33、52、58型是常见亚型，但国内各地区优势亚型不尽相同^[15]。本研究结果显示，江苏地区感染前5位高危型为HPV33、59、56、51、53型，与福州(HPV16、52、58型)，广州(HPV16、31、52、58型)，杭州(HPV16、58、52、33、18型)，深圳(HPV16、58、33、52、56型)，北京(HPV16、58、33型)，天津(HPV16、52型)，西安(HPV16、18、31、33、56型)存在明显的地区差异^{[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]}。这可能与地区经济发展程度、居住环境、生活方式、知识文化水平以及性生活特征等因素有关。

研究表明，20~24岁女性HPV感染率为24.0%，而45~49岁女性HPV感染率则降至3.4%，并且HPV感染率随年龄增长逐渐降低^[16]。Lazcano Ponce等^[17]研究表明，年龄<25岁和>65岁的女性是HPV感染高峰，35~44岁年龄段女性HPV感染率最低(3.17%)。本研究结果显示，HPV年龄特异性具有2个高峰，<25岁是高发年龄组，可能与HPV获得性免疫尚未健全、性生活对象不固定等因素有关；而≥40岁组中高危亚型检出率增高，这可能与中年妇女所承受的社会压力、生理和免疫系统的功能衰退等因素相关，使机体对病毒的清除或抑制能力减弱，导致病毒持续存在和感染。这其中以苏锡常地区检出率最高，可能与经济开发程度、流动人口密度、性行为认识与方式等多种因素密切相关，年龄段更加提前。因此，针对江苏省经济发达城市的高危人群，应将<25岁育龄妇女作为筛查重点，对>40岁女性也应高度重视，密切关注HPV载量、基因型和临床症状，早期诊断并及时治疗宫颈病变，从而有效预防宫颈癌的发生。