肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素、多阶段的过程，是病毒感染、环境因素和个体遗传因素共同作用的结果^{[1, 2]}。流行病学研究表明，乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒慢性感染、黄曲霉毒素B1暴露、嗜酒等是肝癌常见的危险因素^{[3, 4, 5]}。然而，即使在同样的环境因素暴露下，个体对肝癌的易感性也存在差异。研究表明，遗传因素对肝癌的发病具有一定的贡献，在肝癌的病因中，遗传因素约占整个危险因素的3/5^[6]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种重要的信号传导分子，在细胞生长、增殖、分化等过程起中心调控作用。mTOR通路过度活化可以促进肿瘤细胞生长、增殖，以致细胞凋亡、自噬，促进细胞运动、侵袭、转移和血管生成。mTOR基因的某些单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点可能影响mTOR的转录活性和表达水平进而影响蛋白质功能。近期有研究报道，mTOR基因SNP与结肠癌、食管鳞状细胞癌、急性淋巴细胞性白血病和胃癌等肿瘤遗传易感性有关联^{[7, 8, 9, 10]}。但迄今为止，国内外尚无关于mTOR基因SNP与HCC遗传易感性的相关报道。为探讨广西地区人群mTOR基因的潜在生物学功能SNP位点rs2536和rs1883965与HCC发病的关系，为HCC的预防控制提供科学依据，本研究采用以医院为基础的病例对照研究方法，抽取2007年1月—2011年4月在广西医科大学第一附属医院和广西医科大学附属肿瘤医院就诊的1 048例HCC患者和1 052例非肿瘤患者分别作为病例组和对照组人群进行问卷调查和基因分型，结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象

采用以医院为基础的病例对照研究方法，抽取2007年1月—2011年4月在广西医科大学第一附属医院和广西医科大学附属肿瘤医院就诊的1 048例HCC患者和1 052例非肿瘤患者分别作为病例组和对照组人群进行问卷调查和基因分型。本研究通过了广西医科大学生命科学研究伦理委员会审批，所有研究对象均签署了知情同意书。 1.2 方法

(1)问卷调查：采用自行设计调查问卷，由统一培训的调查员进行面访调查。内容包括性别、年龄、民族等一般人口学特征及吸烟、饮酒情况等。其中吸烟指研究对象一生中连续或累积吸烟≥6个月；饮酒指饮酒至少1次/周，且持续≥6个月^[11]。(2)乙型肝炎病毒检测：采用酶联免疫吸附法检测研究对象血清标志物HBsAg，HBsAg阳性则视为乙型肝炎病毒感染。(3)基因分型：在研究对象接受治疗前，采集外周静脉血5 mL。采用酚-氯仿法提取全基因组DNA，-20 ℃保存，待测。应用Taqman MGB实时荧光定量PCR技术进行基因分型，其操作步骤按照美国应用生物系统(ABI)公司 7 500 Fast 实时定量PCR 仪用户手册操作说明进行。PCR反应体系为25 μL，包括2×PCR反应混合物12.50 μL、20×SNP基因分型探针1.25 μL，DNA 1.00 μL(浓度>15 ng/μL)、双蒸水10.25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min，变性92 ℃ 15 s，退火(延伸)60 ℃ 1 min，40个循环。每次检测均设置2个空白对照及2个重复样本作为阳性对照；按随机数字法随机抽取5％的样本进行盲法复测。 1.3 统计分析

应用SPSS 13.0软件进行统计分析。以哈迪-温伯格遗传平衡定律检验研究样本是否具有群体代表性；应用t检验和χ²检验分别分析计量资料和计数资料，运用非条件logistic回归模型计算各变量的比值比(odds ratio，OR)和95%可信区间(confidence interval，CI)，并分析各SNP位点基因型、基因-环境因素交互作用与肝癌遗传易感性的关系。所有分析均为双侧检验，检验水准为α=0.05。 2 结 果 2.1 一般情况

病例组1 048例HCC患者中，男性910例，占86.8%，女性138例，占13.2%；年龄18～70岁，平均年龄(48.32±11.01)岁；汉族708例，占67.6%，少数民族340例，占32.4%；吸烟者402例，占38.4%；饮酒者373例，占35.6%；乙型肝炎病毒感染者876例，占83.6%。对照组1 052例非肿瘤患者中，男性890例，占84.6%，女性162例，占15.4%；年龄18～70岁，平均年龄(47.48±11.75)岁；汉族674例，占64.1%，少数民族378例，占35.9%；吸烟者169例，占16.1%；饮酒者156例，占14.8%；乙型肝炎病毒感染者128例，占12.2%。2组人群一般情况比较，病例组和对照组人群在年龄、性别、民族等方面均衡可比，差异均无统计学意义(P>0.05)；吸烟、饮酒及乙型肝炎病毒感染的分布病例组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)。 2.2 rs2536和rs1883965位点基因型及分布与HCC发病风险的关系(表 1)

病例组和对照组rs2536、rs1883965位点基因型及等位基因频率分布情况比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。在调整了年龄、性别、民族、吸烟、饮酒和乙型肝炎病毒感染等混杂因素后，多因素logistic回归分析结果显示，与rs2536位点TT基因型比较，TC、CC、TC+CC基因型均与HCC发病风险差异无统计学意义(P>0.05)；与rs1883965位点GG基因型比较，GA、AA、GA+AA基因型均与HCC发病风险差异无统计学意义(P>0.05)。

表 1

表 1 rs2536和rs1883965位点基因型分布与HCC发病风险关系 基因位点 病例组 对照组 OR值a 95%CIa 例数 % 例数 % rs2536位点            TT基因型 849 81.01 850 80.80 1.00            TC基因型 186 17.75 188 17.87 1.03 0.74～1.44            CC基因型 13 1.24 14 1.33 0.46 0.16～1.36            TC+CC基因型 199 18.99 202 19.20 0.98 0.71～1.35 rs1883965位点            GG基因型 881 84.06 882 83.84 1.00            GA基因型 165 15.74 160 15.21 1.10 0.77～1.56            AA基因型 2 0.19 10 0.95 0.35 0.04～2.84            GA+AA基因型 167 15.94 170 16.16 1.06 0.75～1.50 注：a校正了年龄、性别、民族、吸烟、饮酒、乙型肝炎病毒感染等混杂因素。

表 1 rs2536和rs1883965位点基因型分布与HCC发病风险关系

分别按年龄、性别、民族、吸烟、饮酒和乙型肝炎病毒感染等因素进行分层分析，结果表明，rs2536和rs1883965位点在各层间与HCC的发病风险均无统计学关联(P>0.05)；上述环境因素与rs2536和rs1883965位点的交互作用与HCC的发病风险差异均无统计学意义(P>0.05)。

表 2

表 2 rs2536位点基因型及其与环境因素交互作用与HCC发病关系的分层分析 环境因素 TT基因型 CT+CC基因型 OR值a 95%CIa P值b 病例组 对照组 病例组 对照组 例数 % 例数 % 例数 % 例数 % 年龄(岁) 0.068     ≤48 456 53.71 481 56.59 104 52.26 124 61.39 0.72 0.46～1.13     >48 393 46.29 369 43.41 95 47.74 78 38.61 1.36 0.86～2.15 性别 0.278     男性 739 87.04 715 84.12 171 85.93 175 86.63 0.93 0.65～1.31     女性 110 12.96 135 15.88 28 14.07 27 13.37 1.41 0.60～3.29 民族 0.877     汉族 573 67.49 544 64.00 135 66.18 130 64.36 1.01 0.69～1.50     少数民族 276 32.51 306 36.00 69 33.82 72 35.64 0.93 0.53～1.65 吸烟 0.449     否 521 61.37 710 83.53 125 62.81 173 85.64 0.90 0.61～1.33     是 328 38.63 140 16.47 74 37.19 29 14.36 1.15 0.62～2.09 饮酒 0.593     否 544 64.08 721 84.82 131 65.83 175 86.63 1.03 0.71～1.50     是 305 35.92 129 15.18 68 34.17 27 13.37 0.87 0.45～1.67 乙型肝炎病毒感染 0.765     无 140 16.49 749 88.12 32 16.08 175 86.63 1.02 0.65～1.58     有 709 83.51 101 11.88 167 83.92 27 13.37 0.91 0.57～1.45 注：a校正了年龄、性别、民族、吸烟、饮酒、乙型肝炎病毒感染等混杂因素；b 交互作用P值。

表 2 rs2536位点基因型及其与环境因素交互作用与HCC发病关系的分层分析

表 3

表 3 rs1883965位点基因型及其与环境因素交互作用与HCC发病关系的分层分析 环境因素 TT基因型 CT+CC基因型 OR值a 95%CIa P值b 病例组 对照组 病例组 对照组 例数 % 例数 % 例数 % 例数 % 年龄(岁)     ≤48 471 53.46 513 58.16 89 53.29 92 54.12 1.01 0.62～1.65 0.866     >48 410 46.54 369 41.84 78 46.71 78 45.88 1.02 0.63～1.69 性别     男性 763 86.61 752 85.26 147 88.02 138 81.18 1.09 0.75～1.60 0.684     女性 118 13.39 130 14.74 20 11.98 32 18.82 1.00 0.41～2.42 民族     汉族 607 68.90 563 63.83 101 60.48 111 65.29 1.07 0.70～1.63 0.925     少数民族 274 31.10 319 36.17 66 39.52 59 34.71 0.92 0.50～1.70 吸烟     否 549 62.32 734 83.22 97 58.08 149 87.65 1.00 0.66～1.52 0.372     是 332 37.68 148 16.78 70 41.92 21 12.35 1.24 0.64～2.40 饮酒     否 578 65.61 747 84.69 97 58.08 149 87.65 0.88 0.58～1.32 0.779     是 303 34.39 135 15.31 70 41.92 21 12.35 1.70 0.86～3.36 乙型肝炎病毒感染     无 148 16.80 768 87.07 24 13.86 156 91.76 0.84 0.51～1.36 0.092     有 733 83.20 114 12.93 143 86.14 14 8.24 1.59 0.88～2.87 注：a校正了年龄、性别、民族、吸烟、饮酒、乙型肝炎病毒感染等混杂因素；b 交互作用P值。

表 3 rs1883965位点基因型及其与环境因素交互作用与HCC发病关系的分层分析

mTOR基因位于人常染色体1p36.2上,编码全长2 549个氨基酸的mTOR蛋白(分子量 289 kd),属于磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶(phosphatidylinositol kinase-related protein kinase,PIKK)家族，具有丝/苏氨酸激酶活性^[12]。mTOR可对细胞外如生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答，它主要通过PI3K/AKT/mTOR和LKB1/AMPK/mTOR信号通路，在细胞的增殖、生长、分化过程中发挥中心调控作用^[13]。由于mTOR对细胞存活起重要作用，mTOR信号通路被认为可能与肿瘤的发生密切相关。研究表明，许多人类恶性肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、肺癌及肝癌等均伴有mTOR信号通路异常^{[14, 15, 16, 17]}。

与肝癌有关的遗传因素复杂，有癌基因的激活、抑癌基因的失活、基因组不稳定性、染色体缺失与获得等。高水平的mTOR活性失调和一些错构瘤综合征相关，包括结节性硬化症相关，PTEN相关错构瘤综合征和黑斑息肉综合征，这些疾病均是由肿瘤抑制基因的基因突变引起mTOR负调控导致的^[15]。研究发现，40%~50%肝癌患者mTOR信号途径被激活，67%HCC患者mTOR蛋白过度表达^{[18, 19, 20]}。Yang等^[21]研究报道，慢性乙型肝炎病毒感染患者肝细胞毛玻璃样变最后演变为HCC，可能为乙型肝炎病毒 pre-S缺失性突变上调Akt/mTOR活性所致，提示mTOR信号通路在乙型肝炎病毒相关肝癌的发病机制中可能起重要作用。

既往已有一些关于mTOR基因多态性与肿瘤遗传易感性的关联研究的报道。Slattery等^[7]研究发现rs105779位点的AG/GG基因型能增加患结肠癌的危险性。Huang等^[8]的研究显示，mTOR基因的rs2536位点TC基因型可以明显降低中国儿童急性淋巴细胞性白血病的发病风险。He等^[9]研究发现rs1883965位点A等位基因能增加患胃癌的风险，尤其在分层分析中rs1883965位点的AG、AA基因型对有吸烟史的人群作用更加明显。Zhu等^[10]的研究发现，rs1883965位点A等位基因能增加患食管鳞状细胞癌风险。然而，本研究结果显示，mTOR基因rs2536和rs1883965位点多态性与HCC发病风险均无统计学关联。分别按年龄、性别、民族、吸烟、饮酒和乙型肝炎病毒感染等因素进行分层分析后，亦未发现rs2536和rs1883965位点在各层间及与上述因素交互作用中与肝癌的发病风险有统计学关联。本研究结果与上述研究结果不一致的原因可能是rs2536和rs1883965位点多态性确实与肝癌遗传易感性无关，也可能与地域、人群和种族等因素不同有关。此外，虽然本研究的病例组和对照组的样本量分别达到1 048和1 052例，但是rs2536位点的CC基因型和rs1883965位点的AA基因型携带者非常少，CC基因型在病例组和对照组中分别为13和14例，AA基因型在病例组和对照组中分别为2和10例。而且，在进行分层分析时，有些变量的样本量则相对偏小，如病例组非乙型肝炎病毒感染者仅170例，对照组的乙型肝炎病毒感染者仅128例，按性别分层后女性HCC患者仅138例。因此，本研究的统计学检验效能受到一定程度的限制。同时，本研究采用的是以医院为基础的病例对照研究，病例和对照均来自医院，可能存在选择偏倚、回忆偏倚等。但是，本研究采取调查前统一培训调查员、应用统一调查表、将病例组与对照组人群在年龄、性别、民族等方面进行频数匹配等措施尽可能地减少了偏倚的产生，在今后的研究中我们将进一步扩大样本量，并在不同人群中进行验证。