蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)是引起人和多种动物腹泻的一种重要机会性致病原虫。介水传播的贾第虫病严重影响公众健康^[1]，含有贾第虫的家畜、人和野生动物排泄物是地表水中贾第虫的主要污染源。世界范围内人群贾第虫的感染率为1%~30%^[2]，中国人群平均感染率为2.52%^[3]。目前，对贾第虫的检测主要是采用镜检方法，由于虫体包囊体积极其微小,在形态上难以区分，粪检贾第虫包囊的漏检率较高^[4]。因此，建立敏感性较高的贾第虫基因检测技术，对预防控制贾第虫感染具有重要意义^[5]。本研究于2011—2012年采用PCR建立贾第虫的基因检测方法，并应用于现场水样和粪便标本中，并与镜检法进行比较，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验材料与主要试剂

1株贾第虫滋养体(中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所惠赠)，1株人源贾第虫包囊(分离自上海市江湾医院的1例贾第虫感染者)，实验所用阴性对照水样为纯净水(购自上海获特满饮料有限公司)，阴性对照粪便标本(为监测点健康人群经检测贾第虫阴性)；DNA提取试剂盒 FastDNA SPIN Kit for Soil(美国MP Biomedicals 公司)，2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技北京有限公司)，牛血清白蛋白(美国Sigma公司)。 1.2 方法 1.2.1 现场水样和粪便标本采集

共采集水样174份，其中上海市8个区的自来水出厂水40份，原水62份，动物饲养场周边池水25份，污水处理厂出厂水29份，游泳池水10份，餐馆养鱼池水8份。出厂水取每份水样100 L，其他水样每份取40 L。粪便标本采自上海市3家医院门诊有腹泻症状(≥3次/d)患者粪便标本210份。 1.2.2 检测方法

水样按照GB 5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法》^[6]进行检测，采用荧光显微镜镜检(简称镜检法)；腹泻粪便采用直接涂片和碘液染色镜检^[4]。每份样品均被分为2份，一份用于PCR检测，另一份用于镜检法检测。 1.2.3 DNA抽提

水样按上述方法过滤、淘洗、离心浓缩后，沉淀用于提取DNA；腹泻粪便经离心沉淀法^[7]浓集后取沉淀提取DNA。提取前分别置液氮2 min、94 ℃ 2 min，反复冻融 3次，破坏包囊壁。采用 FastDNA SPIN Kit for Soil 试剂盒提取水样和粪样中贾第虫包囊基因组DNA。 1.2.4 PCR扩增及其产物检测

贾第虫引物系根据磷酸丙糖异构酶(tim)基因设计的一对引物^[8]，其核苷酸序列为Primer1:5 ′-ATG CCT GCT CGT CGC CCC TTC-3′和Primer2：5 ′-CAC TGG CCA AGC TTC TCG CAG-3 ′，引物由英潍捷基(Invitrogen)上海生物技术有限公司合成。将上述方法制得的DNA作为模板，加入模板2.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L引物各1.5 μL，10 mg/mL BSA 2 μL，ddH₂O 17.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s， 72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸 8 min。对照模板采用隐孢子虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴和华支睾吸虫，并设阴性对照。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图象处理系统摄片观察结果。 1.3 统计分析

采用SPSS 16.0软件录入数据，并进行χ²检验，定量资料满足参数检验的前提条件下，当P<0.05时认为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 PCR产物检测(图 1)

1株贾第虫滋养体和1株贾第虫包囊DNA均被扩增出1条680bp左右的条带，与预计长度相等。而隐孢子虫、刚地弓形虫、溶组织内阿米巴、华支睾吸虫和阴性对照均未见相应条带，所用的引物在PCR反应中显示了高度的特异性。PCR产物经序列测定证实为贾第虫的tim基因片段。

图 1

注：1：阴性对照；2：隐孢子虫；3：刚地弓形虫；4：溶组织内阿米巴；5：华支睾吸虫；6：贾第虫滋养体；7：贾第虫包囊；M：DNA 标志物(100bp)。 图 1 蓝氏贾第鞭毛虫PCR特异性电泳图

应用PCR和镜检法检测的出厂水、游泳池水、餐馆养鱼池水均未检出贾第虫。其他水样中动物饲养场周边池水贾第虫检出率最高，原水最低，两者差异有统计学意义(χ²=10.30，P<0.01)。PCR和镜检法贾第虫检出率差异无统计学意义(χ²=0.45，P>0.05)。PCR法和镜检法相结合，共检出贾第虫阳性24份，其中2种方法均为阳性18份，1份PCR阳性而镜检法阴性，5份镜检法阳性而PCR阴性，2种方法阳性一致性为75.0%(18/24)。

表 1

表 1 水样中蓝氏贾第鞭毛虫检测结果 水样来源 样本数(份) PCR法 镜检法 阳性数(份) 检出率(%) 阳性数(份) 检出率(%) 检出范围(个/10L) 密度均值±标准值(x±s) 原水 62 5 8.1 6 9.7 1～3 1.7±0.8 饲养场周边池水 25 9 36.0 10 40.0 1～7 3.0±1.8 污水厂出水 29 5 17.2 7 24.1 1～4 2.1±1.0 游泳池 10 0 0.0 0 0.0 — — 餐馆养鱼池 8 0 0.0 0 0.0 — — 合计 134 19 14.2 23 17.2 1～7 2.4±1.4

表 1 水样中蓝氏贾第鞭毛虫检测结果

检测3家医院门诊腹泻患者粪便标本210份，其中6份显示贾第虫PCR阳性，阳性率为2.9%；直接涂片和碘液染色镜检检出贾第虫阳性5份，阳性率为2.4%，两者差异无统计学意义(χ²=0.09，P>0.05)。2种方法一致性为83.3%(5/6)。 3 讨 论

随着分子生物学技术的发展，PCR技术在病原检测和分子诊断方面得到了广泛应用，已经成为一种常用的病原分子检测方法。分子生物学检测工具已越来越多的应用于贾第虫检测和传播特征研究中^[9]。大多数研究表明，PCR方法比镜检检测具有更高的灵敏度^{[8, 10, 11]}，但也有PCR检出率低于镜检的报道^[12]。本次PCR检测自来水出厂水未出现贾第虫特异性条带，与镜检法^[6]结果一致。原水和环境水中贾第虫PCR检出率(14.2%)与镜检法(17.2%)比较差异无统计学意义，2种方法阳性结果的一致性为75.0%。分析原因可能由于样品中的某些成分对PCR产生部分抑制作用影响PCR结果；样品中包囊数量少，包囊的随机分配有可能导致PCR和镜检结果不一致。本结果显示镜检检测的部分阳性样品中只检测到1个包囊。因此，PCR方法可对水中贾第虫的污染程度和污染来源进行有效评估。当PCR法和镜检法相结合应用时，效果更好。

对不同来源水样检测，出厂水中未检出贾第虫，与泰国和中国冯玫等^{[13, 14]}检测结果一致。原水中贾第虫检出率低于匈牙利和中国其他地区调查研究^{[15, 16, 17]}，表明目前上海市原水中贾第虫污染水平相对较低。污水处理厂出厂水的贾第虫检出率与中国其他地区调查研究结果类似^[18]。动物饲养场周边池水贾第虫检出率明显高于原水，可能是动物贾第虫感染率较高所致^[19]。游泳池和餐馆养鱼池未检出贾第虫。近年来，游泳池中发生疾病的危险主要与致病原生动物有关，主要包括贾第虫和隐孢子虫^[20],这2种生物有包囊或卵囊，对环境和消毒剂有强抵抗力，并有高度的传染性。我国游泳池人群贾第虫和隐孢子虫感染而出现暴发的报道较少。本次调查也未检出贾第虫，达到了游泳池"推荐水质标准"中贾第虫指标要求。但对于这些场所仍需加强监测，以防不测。

对采自有腹泻症状患者的粪便标本检测，210例中贾第虫PCR阳性为6例，直接涂片和碘液染色镜检阳性为5例，PCR方法更弥补了粪检包囊漏检率较高的不足。表明贾第虫PCR可用于粪便标本的检测，适用于腹泻患者的感染诊断。本结果显示，贾第虫感染是造成腹泻的原因之一，建议临床将贾第虫检测列入临床不明原因腹泻病例的检测项目之中。

目前的检测方法在DNA制备方面操作繁杂、费时费力，检测敏感性还受样品抑制物等影响。本研究使用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒进行DNA提取，快速简单，并且在PCR反应中加入了牛血清白蛋白，尽量克服了抑制物的干扰作用；采用贾第虫tim基因序列建立PCR检测方法，应用于现场饮用水、原水、环境水以及粪便标本的检测，取得了较好的效果，可用于贾第虫的现场流行病学调查和腹泻患者的感染诊断。但检测敏感性尚待进一步提高，在今后实验中还需进一步开展人类致病性虫种的鉴定。