中国公共卫生  2014, Vol. 30 Issue (4): 446-448   PDF    
引用本文
张艳君, 曹彧, 冯永辉. L-精氨酸促进乳腺癌荷瘤小鼠T细胞应答[J]. 中国公共卫生, 2014, 30(4): 446-448.
ZHANG Yan-jun, CAO Yu, FENG Yong-hui. L-arginine promotes T cell mediated immune response in mice with breast cancer[J]. Chinese Journal of Public Health, 2014, 30(4): 446-448.
L-精氨酸促进乳腺癌荷瘤小鼠T细胞应答
张艳君1, 曹彧1, 冯永辉2    
1. 中国医科大学附属第一医院体检中心, 辽宁 沈阳 110001;
2. 中国医科大学免疫学教研室
数字出版日期：2014-3-12 9:22.
基金项目：辽宁省科学技术基金（2009412001-7）
作者简介：张艳君（1970- ），女，天津人，主管护师，本科，研究方向：抗肿瘤免疫。
摘要：目的 探讨L-精氨酸（L-Arg）对乳腺癌的治疗效果及相关机制。方法 制备4T1小鼠乳腺癌荷瘤模型，实验组小鼠于成瘤后连续给予灌胃L-Arg（1.5 g/kg）20 d。动态监测肿瘤组织大小和生存率，处理结束时处死小鼠，制备脾细胞悬液，经流式细胞术检测T细胞亚群和巨噬细胞比例，ELISA检测脾细胞培养上清IFN-γ和TNF-α水平，Griess反应测定上清中NO含量。结果 与对照组相比，L-Arg处理可以抑制肿瘤的生长，延长小鼠生存期；同时，L-Arg处理组中脾细胞中CD4+T（26.53±4.25）%、CD8+T细胞（15.65±0.78）%和巨噬细胞（7.62±0.86）%比例明显高于PBS组[分别为（19.53±2.50）%、（8.78±1.15）%和（2.02±0.12）%]，脾细胞培养上清中IFN-γ（36.56±10.50）pg/mL、TNF-α（22.05±4.93）pg/mL和NO（30.28±6.00）μm的分泌水平也明显高于PBS组[（分别为（15.47±4.96）pg/mL、（14.69±0.81）pg/mL和（6.57±2.21）μM]。结论 L-Arg 可通过促进乳腺癌荷瘤小鼠的T细胞应答，发挥抗肿瘤效应。
关键词： L-精氨酸（L-Arg）     乳腺癌     T细胞应答    
L-arginine promotes T cell mediated immune response in mice with breast cancer
ZHANG Yan-jun1, CAO Yu1, FENG Yong-hui2    
Physical Examination Center, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang, Liaoning Province 110001, China
Abstract: Objective To explore the role of L-arginine (L-Arg)in the treatment of breast cancer.Methods The experimental rodent model of breast cancer was prepared by injecting 4T1 cell line into the right side body of the mouse.The mice in L-Arg group were orally treated with L-Arg(1.5 g/kg)for successive 20 days when the tumor could be detected with palpation.Tumor size and survival rate were dynamically monitored.The mice were sacrificed and the spleen cell suspension was prepared when the treatment ended.Fluorescence activated cell sorter (FACS)was used to detect the T subsets and macrophage.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and Griess reaction were used to detect interferon-gama(IFN-γ),interferon-alpha (TNF-α),and nittric oxide (NO),respectively.Results Compared with the control,treatment with L-Arg could inhibit tumor growth,prolong survival time of the mice.Meanwhile,L-Arg treatment significantly increased the percentages of CD4+ T(26.53±4.25%),CD8+ T cells(15.65±0.78%)and macrophages(7.62±0.86%) compared with the control group(19.53±2.50%,8.78±1.15%,and 2.02±0.12%,respectively) of the spleen cells.The contents of IFN-γ(36.56±10.50 pg/ml),TNF-α(22.05±4.93 pg/ml) and NO(30.28±6.00 μM) levels in L-Arg group were also significantly higher than those of the control group(15.47±4.96 pg/ml,14.69±0.81 pg/ml,and 6.57±2.21 μM,respectively,in the spleen cell culture supernatant.Conclusion L-Arg enhances T cell mediated immune response against tumor in the mice with experimental breast cancer.
Key words: L-arginine     breast cancer     T cell mediated immune response    

近年来，乳腺癌已成为严重威胁中国妇女健康的疾病之一，乳腺癌发病率位居大城市女性肿瘤的第一位，而且发病呈年轻化趋势发展[1]。早发现、早诊断、早治疗会显著提高患者生存机会和生存质量[2]。L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)作为成人的一种条件必需氨基酸，在某些生理或病理条件下，必须通过食物补充以满足机体的需要[3]。L-Arg可被精氨酸酶1或诱导型一氧化氮合酶分别代谢为尿素和L-鸟氨酸或一氧化氮(nitric oxide,NO)和L-瓜氨酸[4]。据报道，人类乳腺癌细胞系可表达精氨酸酶，乳腺癌的发生与精氨酸的耗竭及机体的免疫抑制状态有关[5]，因此，本研究于2012年8月通过乳腺癌4T1荷瘤小鼠模型，采用流式细胞术、ELISA和Griess反应检测T细胞及巨噬细胞的数量及功能，探讨L-Arg对乳腺癌的治疗效果及相关免疫机制，为开发预防或辅助治疗乳腺癌的新药提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料

6～8周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心。实验动物合格证号：2007000542390。 1.2 主要试剂

4T1小鼠乳腺癌细胞株(中国科学院上海细胞库)。L-Arg(美国Sigma公司)；抗-CD3e-FITC(145-2C11)、抗-CD4-PE(H129.19)、抗-CD8α-PerCP(53-6.7)(美国BD Biosciences公司)；抗-F4/80-PerCP cy5.5(BM8)(美国Ebiosciences公司)；TNF-α和IFN-γ ELISA试剂盒(美国R&D公司)。 1.3 方法 1.3.1 实验分组及小鼠荷瘤模型制备

小鼠随机分为实验组(L-Arg组)和对照组(PBS组)，每组10只。4T1小鼠乳腺癌细胞(1×105)皮下注射至小鼠右侧，制备小鼠荷瘤模型。从可以触摸到肿瘤开始，实验组小鼠连续20 d给予灌胃L-Arg(1.5 g/kg)，对照组给予等量的PBS。动态监测肿瘤生长：用卡尺测量肿瘤的长度(L)和宽度(W)，根据下述式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)= 1/2×L×W2。 1.3.2 流式细胞术(FACS)检测

常规制备单细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/mL。取0.1 mL细胞悬液用于FACS检测。参照文献[6]进行抗体染色剂FACS检测。 1.3.3 ELISA检测和Griess反应

参照文献[6]进行脾细胞培养并收集上清，根据相应ELISA试剂盒(美国R＆D公司)说明书检测IFN-γ和TNF-α的水平。同时采用Griess反应测定上清液中NO水平。 1.4 统计分析

数据以(x±s)表示，采用SPSS 16.0软件进行数据统计分析。采用Kaplan-Meyer方法比较2组小鼠的生存期，通过Student′s t检验比较两组之间差异。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 L-Arg处理对4T1荷瘤小鼠生存期和肿瘤生长的影响

与PBS组相比，L-Arg处理组小鼠肿瘤的生长明显受到抑制(图 1A)。同时，PBS组小鼠接种4T1细胞后32~47 d全部死亡，而经L-Arg灌胃处理后，小鼠的生存期明显延长，在接种4T1细胞51 d后才开始死亡(图 1B)。

注：a P<0.005;b P<0.001。 图 1 L-Arg对4T1荷瘤小鼠肿瘤大小和生存期的影响
2.2 L-Arg处理对4T1荷瘤小鼠T细胞和巨噬细胞应答的影响

L-Arg处理后，荷瘤小鼠脾脏的CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例明显高于PBS对照组小鼠。同时，ELISA结果也显示，L-Arg处理组小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ和TNF-α分泌水平也明显高于PBS对照组。

表 1 L-Arg对4T1荷瘤小鼠T细胞和巨噬细胞及培养上清中炎症因子的影响
3 讨 论

尽管联合治疗手段不断创新，但乳腺癌的发病率仍在不断增加[7]。据报道，人类乳腺癌细胞系可表达精氨酸酶I[5]，通过消耗机体的L-Arg，导致T细胞功能下降。而L-Arg作为一种条件必需氨基酸，当消耗大于产生能力时，必须通过食物补充以满足机体的需要。肿瘤的发生与机体的免疫功能低下密切相关。T细胞免疫在抗肿瘤的过程中发挥不可替代的作用，CD4+Th1细胞和CD8+CTL细胞是具有特异性抗肿瘤的关键效应细胞。与正常人相比，肿瘤患者往往表现为T细胞功能低下。L-Arg的消耗能够诱导T细胞的低应答状态，降低T细胞的增殖和CD3ζ链的表达[8, 9]。

CD4+Th1细胞通过分泌IFN-γ促进巨噬细胞的活化。一方面，活化的巨噬细胞可提呈肿瘤抗原给T细胞，进一步促进T细胞活化，杀伤肿瘤细胞[10]。另一方面，巨噬细胞作为效应细胞还可释放出高浓度的NO发挥肿瘤杀伤作用[11]。研究表明，高水平NO可以增强凋亡相关基因和抗致癌基因的表达水平[12]。膳食补充精氨酸可通过增加分泌NO而增强NK细胞活性，从而抑制结肠癌的发展[13]。本实验结果显示，给予L-Arg后，巨噬细胞的比例以及NO的分泌水平均明显升高。此外，NO的产生也可能是L-Arg经iNOS代谢的结果。因此，本研究进一步证实膳食补充L-Arg可作为乳腺癌的有效辅助治疗手段，其通过上调宿主的T细胞免疫应答，促进NO的产生，发挥抗肿瘤效应。

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