抗菌肽广泛存在于动、植物中，在生物体内发现的抗菌肽已超过2 000种，昆虫抗菌肽已多达200多种^[1]，其中一些抗菌肽的基因、结构、生物学效应及作用机制已经阐明。抗菌肽抗菌谱广，对肿瘤细胞、病毒、真菌等均有杀伤作用，甚至对弓形虫等原虫也有抑制作用^[2]，但对正常的真核细胞无毒或低毒，且不易产生耐药性^[3]。因此抗菌肽有望成为一类新型抗菌、抗肿瘤和抗寄生虫药物。抗菌肽因成分复杂，提取、纯化及化学合成昂贵，且不易标准化，是制约其商品化的主要问题，因此通过基因工程规模生产备受关注。基因工程规模生产抗菌肽，稳定、高效的表达系统是关键。昆虫细胞-杆状病毒表达系统作为一种高效、大容量、表达产物具有生物活性的真核表达系统，其杆状病毒多角体蛋白的超强启动子可以高效表达异源蛋白，成为研究各种蛋白的重要工具。本研究选择家蝇抗菌肽attacin为目标基因，利用含有杆状病毒穿梭载体构建表达载体，为其进一步在昆虫细胞的表达及对表达产物的生物学活性研究提供实验依据。结果报告如下。

大肠杆菌DH5α、DH10Bac和质粒PUC57、pFastBac^TM(上海生工生物工程有限公司)，dNTP Mix、TaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶EcoR I、Pst I(美国Promega公司)；M13特异引物由上海生工生物技术有限公司合成，上游:5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′,下游:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。

根据Genbank登录号AY460106的序列号委托上海生工生物工程有限公司合成家蝇抗菌肽attacin基因，基因全长627 bp。将合成目的基因attacin克隆入PUC57载体质粒(含氨苄青霉素抗性),经蓝白斑筛选后上海生工测序获得阳性克隆；转化入DH5α感受态细胞进行扩增。PUC57重组质粒经ECOR I、Pst I双酶切后，再将次级片段亚克隆入pFastBac^TM供体质粒，上海生工生物工程有限公司测序鉴定为阳性克隆。重组pFastBac供体质粒转入DH10Bac细胞，并涂于含有β-半乳糖苷酶显色底物(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-gal)和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)的筛选平板(含庆大霉素、卡那霉素及四环素抗性)挑取阳性克隆，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)鉴定，产物经1%琼脂糖凝胶电泳。PCR反应采用50 μL反应体系：DNA 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，50 mmol/L MgCl 1.5 μL，M13特异引物各1.25 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，蒸馏水38.5 μL。反应条件为93 ℃预变性3 min,94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸5 min,共35个循环，72 ℃终延伸7 min。选取其中一个阳性克隆菌扩增培养，裂解，提取重组bacmid(bacmid-pFastBac^TM-attacin)，1%琼脂糖凝胶电泳，大连宝生物测序鉴定。

目的基因attacin克隆入载体PUC57质粒,经蓝白斑筛选后上海生工测序表明获得阳性克隆；转化入DH5α感受态细胞进行扩增，PUC57重组质粒经EcoR I、Pst I双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现与预期大小一致的长度约为700 bp目的基因和2710 bp PUC57质粒条带。

将次级片段亚克隆入pFastBac^TM供体质粒，将重组pFastBac供体质粒转入DH10Bac细胞，鉴定为阳性克隆后提取重组Bacmid。重组bacmid进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳。未插入目的片段的pFastBac供体质粒长度为2300 bp,重组bacmid的PCR产物约为2927 bp,提示已成功构建家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体bacmid-pFastBac^TM-attacin。阳性克隆菌扩增培养，裂解，提取重组bacmid(>135 kb)，测序结果与预期一致。

图 1

注：M：标准分子量；(-)：阴性对照；1、3、5号为阳性克隆；2、4、6为阴性克隆。 图 1 重组Bacmid DNA的PCR鉴定

基因工程技术研究开发抗菌肽还有许多尚未解决的问题：原核表达系统虽然操作简便，但抗菌肽基因作为真核基因在原核系统中表达的蛋白往往不能有效正确的翻译，从而因空间结构上的差异影响表达抗菌肽的活性；抗菌肽对表达载体都有抗杀作用，表达产物易降解，因而目前抗菌肽在原核中表达多采用融合表达方式^[4]，但采用融合蛋白的形式表达抗菌肽会增加其后加工的难度^[5]。因此，选择真核表达系统成为目前进行抗菌肽基因工程研究的热点。酵母表达系统为真核表达系统，但存在酵母培养密度低、表达量少、产物酰胺化不完全影响活性的问题。王婷婷等^[6]采用一个基因多拷贝同向串联融合表达后克隆到酵母表达载体中，获得稳定高表达的目的蛋白。

昆虫细胞-杆状病毒表达系统作为一种高效、安全、大容量、表达产物具有生物活性的真核表达系统，其杆状病毒多角体蛋白的超强启动子可以高效表达异源蛋白^[7,8]。昆虫细胞有完善的翻译加工修饰，使重组蛋白具有生物活性，且较易从无血清上清纯化蛋白、无内毒素污染等优点。选择昆虫细胞系 建立抗菌肽基因真核表达系统，是基因工程规模生 产抗菌肽的重要手段。自1991年Hellers等将 cecropin的前体片段克隆到苜蓿斜纹蛾多角体病毒 启动子的下游，构建了昆虫病毒表达系统，一些学者先后运用昆虫培养细胞Sf9等成功构建抗菌肽基因的表达系统，且产物产量增加并保留特有的生物活性^[9]。

杆状病毒穿梭载体bacmid(baculovirus shuttle vector)构建是杆状病毒表达载体系统(baculovirous expression vector system，BEVS)的关键性改建，病毒基因修饰后在大肠杆菌内如大质粒那样复制，现已商品化^[10]。本研究采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，将attacin目的基因克隆入PUC57质粒，重组质粒经双酶切后连接到pFastBac^TM供体质粒，再转染E.coli DH10Bac，成功构建含家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体(bacmid-pFastBac^TM-attacin)，可为进一步自建家蝇胚胎细胞表达及对表达产物的生物学活性研究提供实验依据。