盐酸阿比朵尔(arbidol hydrochloride，Ahyd)，是一种非核苷类抗病毒药物和免疫刺激剂，主要用于治疗和预防成人及儿童由于甲、乙型流感病毒所引起的流行性感冒及其他急性病毒性呼吸道感染^{[1 ,2]}。近年来研究表明，Ahyd除了可以抑制流感病毒外，对多种有无包膜的病毒均有抑制作用^[3]。本研究采用噻唑蓝 [3-4,5-dimethylthiazo(-2-yl)-2,5,-diphenylte-trazolium bromide，MTT] 和荧光定量方法检测各实验组病毒感染细胞的存活率及各实验组呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的相对变化量，以探讨Ahyd对RSV繁殖的抑制作用。

人羊膜细胞(吉林大学药学院分子病毒实验室保存)；RSV(吉林大学药学院分子病毒实验室保存)。

Ahyd(湖北潜江生物制品有限公司)；利巴韦林(ribavirin)(中国天津新正药业集团)，Trizol 试剂(美国Invitrogen公司)，二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(美国AMRESCO公司)，MTT (美国Sigma公司)，逆转录试剂盒以及实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒(日本TaKaRa公司),RSV病毒PCR引物(上游5′-TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT-3′，下游5′-ACATACCTATTAACCCAGTGAAT-3′)，管家基因GADPH的PCR引物(上游5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′)均由生工生物工程上海有限公司合成，酶标仪(德国Tecan公司)，显微镜(日本OLYMPUS公司)，荧光定量PCR扩增仪(中国博日杭州有限公司)。

称取100 mg Ahyd溶解于5 mL DMSO中，过滤除菌后,用含2%小牛血清的RPMI 1640 培养基稀释成以下8个浓度：100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 μg/mL，同时将DMSO也稀释成相应的浓度作为溶剂对照。传代人羊膜细胞于96孔培养板，待长成单层后加入上述浓度的药物，每个浓度组4个复孔，48 h后观察结果。

将Ahyd配制成如下10个浓度:20、18、16、14、12、10、8、6、4、2 μg/mL；传代人羊膜细胞于96孔培养板，待长成单层后，加入上述浓度的含药维持液，24 h后吸出，吸附100 TCID₅₀/0.1 mL的RSV病毒2 h后，再加入相应浓度的药物维持液。同时设病毒对照和正常细胞对照，待病毒对照细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)为CPE++++，正常细胞对照为CPE----时观察记录实验结果。

实验分为6组：Ⅰ组先加入含相应浓度Ahyd的维持液2 h后吸出，再吸附RSV病毒2 h后吸出，再加入含相应浓度Ahyd的维持液，以探讨Ahyd对RSV病毒的阻断和预防作用；Ⅱ组Ahyd与RSV病毒先作用2 h后再加入细胞，吸附2 h后弃掉，再加入含相应浓度Ahyd的维持液，以探讨Ahyd对RSV病毒的直接灭活作用；Ⅲ组先吸附RSV病毒2 h后弃掉，再加入含相应浓度Ahyd的维持液，以探讨Ahyd对病毒的生物合成的抑制作用；每个实验组又分别设上述筛选的3个实验浓度。Ⅳ组为阳性药物利巴韦林组；Ⅴ组为病毒对照组；Ⅵ组为正常细胞对照组。

传代人羊膜细胞于96孔培养板，24 h长成单层后按上述分组方法进行实验，48 h后病毒对照组细胞CPE++++，正常细胞对照为CPE----观察记录实验结果，并用MTT法检测Ahyd对感染细胞的保护率^[4]。

传代人羊膜细胞于24孔培养板，长成单层后按上述分组方法进行实验，每组2个复孔。待病毒对照CPE++++，弃细胞上清液，0.25%胰酶消化后，收集细胞，PBS洗3次，加入300 μL Trizol细胞裂解液，冰上振荡20 min，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液-20 ℃保存，按常规方法提取RSV病毒RNA，按试剂盒说明书进行逆转录和实时荧光定量PCR，以检测RSV病毒载量，PCR相对定量分析法以2^-△△Ct方法计算。

Ahyd的半数中毒浓度TD₅₀为15.6 μg/mL，最大无毒浓度为TD₀为10 μg/mL。利巴韦林的最大无毒浓度TD₀为250 μg/mL，半数中度浓度TD₅₀是500 μg/mL。

Ahyd浓度在2～10 μg/mL对病毒均有抑制作用,实验时选取Ahyd低、中、高(2、4、8 μg/mL)3个剂量组用于体外细胞试验，利巴韦林选取最大无毒浓度250 μg/mL为阳性药物浓度。

正常细胞对照组(Ⅵ组)的细胞存活率为98.6%，病毒对照组(Ⅴ组)的细胞存活率为20.2%，阳性药物利巴韦林组(Ⅳ组)的细胞存活率为78.3%，而Ahyd高、中、低3个剂量实验结果显示，先加药物组(Ⅰ组)对病毒的抑制作用最强，而且细胞存活率随着浓度的降低而降低(71.8%、52.4%、33.1%),与病毒对照组(Ⅴ组)比较，3个剂量组差异均有统计学意义(P<0.01)；药物与病毒同时作用组(Ⅱ组)对感染细胞的保护率分别为62.3%、46.7%、29.6%，与病毒对照组(Ⅴ组)比较3个剂量组差异均有统计学意义(P<0.01)；先加病毒后加药物组(Ⅲ组)对感染细胞的保护率分别为60.9%、43.3%、28.7%，与病毒对照组比较，3个剂量组差异均有统计学意义(P<0.01)。

各实验组细胞裂解液中RSV病毒的荧光定量 RT-PCR结果显示，病毒对照组(Ⅴ组)和阳性药物利巴韦林组(Ⅳ组)病毒RNA的2^-△△Ct平均值分别为9.33和3.08，表明利巴韦林对RSV病毒具有较强的抑制作用。其他3个实验组中RSV病毒RNA的2^-△△Ct的平均值与病毒对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，且各实验组高、中、低3个剂量实验组的病毒表达量逐渐降低，2^-△△Ct平均值分别为Ⅰ组3.21、5.23、7.25，Ⅱ组4.85、5.77、7.89，Ⅲ组4.98、5.89、7.94。表明Ahyd具有较强的抑制RSV病毒繁殖的作用，且有剂量依赖性。

RSV是一种RNA病毒，属副粘液病毒科。该病毒经空气飞沫和密切接触传播，主要表现为上呼吸道感染，近十年来合胞病毒肺炎及毛细支气管炎占中国婴幼儿病毒性肺炎第1位，因此，其预防和治疗尤为重要。

本研究中，Ⅰ组是探讨Ahyd对病毒的阻断和预防作用，Ⅱ组是探讨Ahyd对病毒的直接灭活作用，Ⅲ组是探讨Ahyd对病毒的生物合成的抑制作用。实验结果显示，Ⅰ组的抗病毒作用最强，对感染病毒细胞的保护率最高，表明Ahyd对RSV具有一定的抑制作用，它能够影响病毒的吸附和穿入的某些环节，使得细胞得到一定的保护；Ⅱ组和Ⅲ组对感染细胞也有一定的保护作用，但是没有Ⅰ组的效果好，表明Ahyd对于吸附于细胞表面及进入细胞内的病毒也具有一定的抑制作用，它能够影响病毒在细胞内的生物合成，抑制病毒的复制和繁殖，从而对感染细胞起到保护作用；而2组之间无明显差异，表明Ahyd对病毒无直接杀伤作用。

Ahyd的抗病毒作用与其增强机体的免疫功能密切相关^[6]。Ahyd是一种生物反应增强剂和调节剂，具有抗氧化、免疫刺激和诱导产生干扰素的作用^[7]，具有提高感染细胞的免疫力，增加细胞膜的稳定性，抑制细胞病变，促进细胞修复等功能。因此Ahyd表现出较强的抗病毒作用，是一种有待开发的抗病毒类药物。