中国公共卫生  2013, Vol. 29 Issue (11): 1647-1650   PDF    
引用本文
田克诚, 周晖, 阚飙, 刁保卫, 唐光鹏, 姚光海, 游旅, 蔡星和. 贵州省1959—2006年伤寒菌株PFGE分型及分布特征[J]. 中国公共卫生, 2013, 29(11): 1647-1650.
TIAN Ke-cheng, ZHOU Hui, KAN Biao, et al. Pulsed field gel electrophoresis based molecular typing and epidemiologic analysis of 214 strains of Salmonella typhi isolated in Guizhou province from 1959 to 2006[J]. Chinese Journal of Public Health, 2013, 29(11): 1647-1650.
贵州省1959—2006年伤寒菌株PFGE分型及分布特征
田克诚1, 周晖1, 阚飙2, 刁保卫2, 唐光鹏1, 姚光海1, 游旅1, 蔡星和1    
1. 贵州省疾病预防控制中心, 贵阳 550004;
2. 中国疾病预防控制中心
数字出版日期：2013-10-16 15:47
作者简介：田克诚(1954-),男,河北唐山人,副主任技师,大专,主要从事细菌性疾病控制工作。
摘要：目的 了解贵州省1959-2006年214株伤寒沙门菌的分子流行病学特征,为追踪传染来源、查找传播途径提供线索。方法 用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)方对贵州省214株分离自不同时间、不同地区的伤寒沙门菌进行PFGE带型分析及其流行病学特征研究。结果 根据细菌染色体DNA的XbaI酶切图谱,将贵州省214株伤寒沙门氏菌分成85个带型,除CN0004、CN0016和CN0018等3个带型在国内已有发现外,其余82个带型在国内为首次发现;85个带型中菌株数在5株以上的有13个带型,占15.3%;菌株数2株以上的有12个带型,占14.1%;菌株数为1株的有60个带型,占70.6%。结论 伤寒沙门菌PFGE带型复杂,存在明显的基因多态性,是造成贵州省伤寒流行时间长,流行范围广的主要原因。
关键词： 伤寒沙门菌     脉冲电场凝胶电泳(PFGE)     细菌带型     流行病学特征    
Pulsed field gel electrophoresis based molecular typing and epidemiologic analysis of 214 strains of Salmonella typhi isolated in Guizhou province from 1959 to 2006
TIAN Ke-cheng1, ZHOU Hui1, KAN Biao2, et al    
Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Gui-yang, Guizhou Province 550004, China
Abstract: Objective To examine molecular epidemiologic characteristics and similarity of 214 strains of Salmonella typhi(S.typhi) isolated in Guizhou province from 1959 to 2006,and to provide clues for source tracking of infection and finding the route of transmission.Methods Pulsed field gel electrophoresis(PFGE) was applied to type 214 strains of Salmonella isolates.Results According to the restriction map of Xba I,the 214 strains of S.typhi strains were classified in to 85 PFGE types.And 82 types,except for type CN0004,CN0016 and CN0018,were found in China for the first time.Among the PFGE types,there were 13 types with more than 5 strains accounting for 5.1%,12 types with more than 2 strains accounting for 15.31%,and 60 types with more than 1 strains accounting for 70.6%.Conclusion The PFGE types of S.typhi isolated in Guizhou province were complex,with obvious gene polymorphism,which may be the main reason to cause widely and long time typhoid epidemic in Guizhou province.
Key words: Salmonella typhi     PFGE     bacteria band     epidemiological characteristics    

在探讨伤寒流行的内在因素和伤寒沙门菌基因相似性、耐药性和鉴别传染来源与追踪传播途径方面，传统的细菌表型、血清学及噬菌体等分型技术已不能满足要求[1, 2]。目前脉冲场凝胶电泳(pulsedfield gel electrophoresis，PFGE)技术是国内、外广泛应用的细菌分型方法之一，具有重复性好、分辨率高、结果稳定等优势[3]，借用电泳条带图谱，比较菌株相似性，直接或间接反映病原体DNA序列的改变[4]。本研究利用PFGE分型技术，对贵州省214株分离自不同时间、不同地区的伤寒沙门菌进行PFGE带型分析及其流行病学特征研究，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 菌株来源

按菌株分离时间和地区随机选取1959—2006年214株作为实验菌株,菌株覆盖全省9市(地、州)35个县，其中安顺市74株、毕节地区42株、贵阳市27株、铜仁地区24株、黔西南州16株、遵义市13株、黔南州10株、六盘水市7株、黔东南州1株。菌株经复苏鉴定后进行分型试验。相对分子质量标准菌株H9812为沙门菌Braenderup 血清型菌株(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所)。 1.2 主要试剂与仪器

CHEF-DR H Ⅲ system脉冲场凝胶电泳仪、Gel Doc 2000凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司),bioM-rieux Vitek Colorimeter(法国梅里埃公司)。限制性内切酶XbaI[宝生物工程(大连)有限公司],蛋白酶K(德国Merck公司),SeaKemGold Agarose(SKG)琼脂糖(美国Cambrex公司)。 1.3 实验方法 1.3.1 菌体包埋及裂解

刮取适量生长良好的新鲜细菌，均匀悬浊于盛有2 mL细胞悬浊液中，测其A值，取400 μL细菌悬浊液于 Eppendorf管中，37 ℃水浴中孵育5 min，加入20 μL蛋白酶K(储存液浓度为20 mg/mL)混匀，使其终浓度为0.5 mg/mL，再加入400 μL的1% SKG，轻轻混匀后将混合物加入模具，室温下凝固10~15 min。 1.3.2 细胞裂解

胶块放入5 mL 0.1 mg/mL蛋白酶K试管中，置54 ℃水浴摇床中(170 r/min)孵育2 h倒掉，加纯水15 mL，置50 ℃水浴摇床10 min(2次)，加15 mL预热缓冲液，在50 ℃浴摇床15 min(3次)倒掉，加入10 mL缓冲液放4 ℃冰箱保存备用。 1.3.3 DNA酶切及电泳

取2 mm宽胶块放入1.5 mL Eppendorf管中，加200 μL缓冲液置37 ℃水浴中平衡10~15 min后弃液。加200 μL含50 U XbaI酶切液,37 ℃孵育2 h，将酶切好胶块粘在梳齿上放入胶槽中，加入100 mL已熔化的1%SKG，室温下凝固30 min；电泳：电压6.0 V/cm,120%脉冲夹角,起始脉冲时间1 s,终止脉冲时间20 s,电泳至最后获取的图像中H9812最小片段距胶底端1.0~1.5 cm,电泳20 h，1 mg/L溴化乙啶染色30 min,置纯水中脱色60 min,读胶仪中成像。 1.3.4 电泳图像聚类分析

脉冲场电泳图谱，在中国疾病预防控制中心传染病所用BioNumerics 3.0数据库软件进行处理,聚类图类型根据非加权配对算术平均法构建,条带位置差异容许度为0.5%,不同菌株电泳条带的相似性系数用Dice系数(F值×100%)表示,F=2nxy/(nx+ny),其中nx是菌株x总的电泳片段数,ny是菌株y总的电泳片段数,nxy是菌株x和菌株y相同的电泳片段数，F值反映不同菌株电泳条带的相似程度,范围在0~1,0：完全不相关,1：完全相同；出现不同条带即判定为不同带型。 2 结 果 2.1 214株伤寒菌株分型概况(图 1)

214株伤寒菌株DNA经XbaI酶切和PFGE电泳后，根据不同菌株电泳条带的相似程度进行分型，相似性系数为100%归为一类型，根据PulseNet的命名原则,将214株伤寒菌株分85个带型，具有≥2株的伤寒沙门菌PFGE带型27个，占31.76%，1株带型58个，占68.24%。

注：M：质量标准菌株 H9812。 图 1 部分伤寒沙门菌株PFGE电泳图谱
2.2 PFGE分型与时间分布(表 1)

214株伤寒沙门菌来源于6个年代，其中50年代8株分7个带型(8.24%)，60年代21株分12个带型(14.12%)，70年代19株分9个带型(10.59%)，80年代62株分36个带型(42.35%)，90年代28株分13个带型(15.29%)，2003—2006年76株菌分22个型，占25.88%。从分型结果看，CN0086带型主要在80年代，CN0087带型则在1980—2006年均有。

表 1 贵州省214株不同时间的伤寒沙门氏菌PFGE带型分布
2.3 PFGE分型与地区分布(表 2)

214株伤寒沙门菌分布在9市(地、州)的35个县，安顺市(地区)74株分29型(34.12%)、毕节地区42株分23型(27.06%)、贵阳市27株分18型(21.18%)、遵义地区11株分10型(11.76%)、铜仁地区24株分9型(10.59%)、黔西南州16株分8型(9.41%)、黔南州10株分5型、六盘水市7株分4型(4.71%)、黔东南州1株1型；贵阳、毕节、安顺等地区带型较复杂；贵阳、六盘水、黔西南、毕节、安顺、黔南等多个市、州(地)均出现CN0087带型。

表 2 贵州省214株不同地区的伤寒沙门氏菌PFGE带型分布
3 讨 论

贵州省214株伤寒沙门菌经XbaI酶切、PFGE分型及聚类分析，结果分为85个带型，除CN0004、CN0016、CN0018等3个带型在国内已有报道外，其余82个均在国内首次发现，填补了国家PulseNet China数据库中伤寒沙门菌分型数据空白；85个带型中，带型>2株27个(31.8%)，带型1株的58个(68.2%)，提示贵州省1959—2006年伤寒沙门菌分离株PFGE图谱带型多、菌型复杂，存在明显的基因多态性。

不同时间PFGE带型分布中，50年代菌株分7个带型，60年代菌株分12个带型，70年代菌株分9个带型，80年代菌株分36个带型，90年代菌株分13个带型，2000—2006年菌株分22个带型；随时间推移，菌型逐渐增多，80年代菌型最多。50—70年代连续分别检出CN0018型、1970—2006年连续多年检出CN0087型菌株，提示这2种带型具有优势性，且菌型较稳定。PFGE带型较复杂的有安顺市、毕节地区、贵阳市、黔东南州，分别为29个带型(34.12%)、23个带型(27.06%)、18个带型(21.18%)，其次是遵义市、铜仁地区、黔西南州、黔南州、六盘水市,分别为10个带型(11.76%)、9个带型(10.59%)、8个带型(9.41%)、5个带型(5.88%)、4个带型(4.71%)，黔东南州只有1个带型(1.18%)。

由于伤寒沙门菌DNA序列的改变，形成基因的多态性，通过复杂多变带型表现出来，不同带型菌株在时间和空间的变化是造成一年四季均有局部流行和散发病例，这也是造成贵州伤寒发病率保持较高水平的主要原因。

参考文献
[1] 康梅,申艳娜.PFGE 在医院内感染细菌的分子流行病学方面的应用[J].华西医学,2002,17(4):573-574.
[2] 甘莉萍,刘渠,陈应坚,等.脉冲凝胶电泳分型在伤寒暴发中的应用[J].现代预防医学,2006,33(1):63-65.
[3] Hopkins KL,Hilton AC.Methods available for the sub-typing of Escherichia coli O157[J].World J Microbiol Biotechnol,2000,16:741-748.
[4] 王丽丽,徐建国.脉冲场凝胶电泳技术(PFGE) 在分子分型中的应用现状[J].疾病监测,2006,21(5):276-279.