中国公共卫生  2013, Vol. 29 Issue (11): 1635-1637   PDF    
引用本文
李玉芳, 刘坤, 杨智航, 符文双, 巴亚萍. 川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注后occludin表达影响[J]. 中国公共卫生, 2013, 29(11): 1635-1637.
LI Yu-fang, LIU Kun, YANG Zhi-hang, et al. Protective effect of tetramethylpyrazine on expression of occludin after cerebral ischemia and reperfusion in rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2013, 29(11): 1635-1637.
川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注后occludin表达影响
李玉芳1, 刘坤1, 杨智航1, 符文双2, 巴亚萍3    
1. 沈阳医学院基础医学院生理教研室, 辽宁 沈阳 110034;
2. 沈阳医学院基础医学院机能实验中心;
3. 沈阳医学院11级临床本科学生
数字出版日期：2013-10-16 15:37
基金项目：沈阳市科技局计划项目(F10-205-1-21)
作者简介：李玉芳(1970-),女,辽宁沈阳人,副教授,硕士,研究方向:脑血管疾病的机制。
摘要：目的 研究川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注后紧密连接相关蛋白occludin表达的影响。方法 采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型,应用伊文氏兰法检测血脑屏障的通透性,免疫组化法、RT-PCR法及western blot法测定缺血再灌注脑组织occludin的表达。结果 Western blot结果,缺血侧脑组织occludin蛋白表达再灌注3 h组(0.154 9±0.021 3)和72 h组(0.133 6±0.024 5)明显低于假手术组(0.334 7±0.035 7)(P<0.05),川芎嗪治疗3 h组(0.233 1±0.032 7)和72 h组(0.214 3±0.034 7)均明显高于上述同时间点再灌注组(P<0.05)。结论 大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障损伤与occludin表达下调密切相关,川芎嗪可能通过上调occludin的表达,恢复紧密连接的功能,降低缺血再灌注后血脑屏障的通透性来减轻缺血再灌注后脑水肿。
关键词： 川芎嗪     脑缺血再灌注     occludin    
Protective effect of tetramethylpyrazine on expression of occludin after cerebral ischemia and reperfusion in rats
LI Yu-fang1, LIU Kun1, YANG Zhi-hang1, et al    
Department of Physiology, School of Basic Medical Science, Shengyang Medical College, Shenyang 110043, China
Abstract: Objective To study the effects of tetramethylpyrazine(TMP) on expression of occludin after brain ischemia-reperfusion(I/R)in rats.Methods The focal cerebral ischemia-reperfusion model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established with intraluminal suture.The change of the permeability of blood-brain barrier(BBB) was detected using Evans blue assay.The expression of occludin was detected wih immunohischemistry assay,real-time reverse transcription PCR(RT-PCR) and western blot.Results The expression of occludin decreased significantly at the end of 3 hour and 72 hour of I/R group.The expression of occludin in TMP group was found significantly increased compared with that of the I/R group at the same time.Conclusion The down-regulation of occludin may be involved in the increase of BBB permeability induced by cerebral I/R injury;the up-regulation of occludin and recovery of function of tight junction and integrity of BBB may be one of the pathways of TMP in inhibition of cerebral edema after reperfusion.
Key words: tetramethylpyrazine     brain ischemia-reperfusion     occludin    

及早溶栓是缺血性脑血管疾病发作时最有效的治疗方法，但是快速溶栓后，脑缺血再灌注会引起一系列的脑组织损伤，包括神经细胞代谢紊乱、血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)通透性增加、白细胞浸润等，严重时甚至引起脑水肿和溶栓后的颅内出血[1]，有研究认为BBB的损伤是脑缺血早期死亡的主要危险因素之一[2]，减轻脑缺血再灌注带来的BBB的损伤，对于临床治疗缺血性脑血管疾病有重要意义。从川芎根茎中提取的有效成分川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)对BBB具有保护作用，为进一步探讨川芎嗪改善脑缺血再灌注后BBB的损伤机制，本研究利用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，检测川芎嗪是否能通过上调紧密连接相关蛋白occludin的表达来恢复紧密连接的结构和功能，从而达到减轻脑缺血再灌注后脑水肿的治疗作用。 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

健康成年SD大鼠160只，雌雄不限，体重200~250 g(沈阳医学院实验动物中心，scxk(辽)2010-0001)。根据Jiao等[3]试验证实大鼠脑缺血再灌注后BBB通透性增高于再灌注3和72 h存在2个峰值，将大鼠随机分为：假手术组、再灌注3 h组、再灌注3 h川芎嗪治疗组、再灌注72 h组、再灌注72 h川芎嗪治疗组。伊文斯兰(Evans blue，EB)(美国Fluka公司)，occludin抗体(abcom)，β-actin抗体(Santa Cruz)，川芎嗪(苏州二叶制药有限公司)，PV超敏试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，浓缩型二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒(宝生物工程有限公司)，Marker(宝生物工程有限公司，100bp ladder)，occludin及β-actin引物(生工生物工程有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 大鼠局灶性脑缺血模型制备

采用大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血模型[4]。大鼠苏醒后，参照Longa等[5] 的方法进行神经功能缺损评分，1~3分的动物可选为实验动物。川芎嗪治疗组术后2 h开始川芎嗪腹腔给药(40 mg/kg)，1次/d，至处死动物前1 d，对照组等量生理盐水腹腔注射。 1.2.2 BBB通透性测定

用EB的渗出量定量估计BBB的通透性[6]。应用RF-540荧光分光光度计(λ=632 nm)测定EB荧光光度值(A)，根据EB标准曲线计算各样本EB含量，反映BBB通透性的改变。 1.2.3 免疫组化定量测定Occludin的表达

标本置于4%多聚甲醛中固定，制成冰冻切片。occludin为兔抗人抗体，稀释比1∶100，按PV超敏试剂盒说明书进行，DAB显色。以磷酸盐缓冲液(PBS)替换一抗做为阴性对照。Motic Images Advanced 3.2图像分析系统采集图片，检测occludin平均光密度值。 1.2.4 Western blot检测occludin的表达

Western blot检测步骤参照文献[6]操作，occludin为兔抗人抗体，稀释比1∶100，以β-actin为内对照，采用Fluor Chen 2.0软件对各条带的整合光密度值(integrated densityvalue，IDV)进行定量分析，结果以occludin//β-actin的IDV比值表示。 1.2.5 RT-PCR法检测缺血脑组织微血管段occludin的mRNA表达

参照试剂盒说明书及文献[7]方法操作，Occludin上游引物为5′-TTGCTTCATCGCTTCCTTG-3′，下游引物为5′-TCCATCTTTCTTCGGG-TTTT-3′，反应产物375 bp。β-actin上游引物为5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT3′，下游引物为5′-AAAGAAAGGGTGTAAACGCA-3′，反应产物493 bp。Gel-pro Analyzer PCR软件进行图像分析，结果以occludin/β-actin的IDV比值表示。 1.3 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，各组实验值以x±s表示，2组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计性学意义。 2 结 果 2.1 血脑屏障通透性变化

假手术组大鼠脑组织未见蓝染，再灌注3 h和72 h缺血侧脑组织蓝染，川芎嗪治疗组缺血侧脑组织蓝染程度明显减轻。与假手术组相比，再灌注3 h和72 h组缺血侧脑组织EB含量均明显高于假手术组(P<0.05)，川芎嗪治疗组缺血侧脑组织EB含量均低于同时间点再灌注组(P<0.05)。 2.2 免疫组化法检测occludin蛋白分布、表达的变化(图 1)

Occludin主要表达在微血管内皮细胞，胶质细胞上未见明显表达。在假手术组occludin沿脑微血管持续表达，呈现连续分布状态，在缺血侧脑组织occludin沿微血管表达再灌注3 h组(0.246 8±0.022 1)和72 h组(0.216 4±0.031 3)均低于假手术组(0.430 9±0.063 2)(P<0.05)，川芎嗪治疗3 h组(0.341 5±0.021 3)和72 h组(0.326 5±0.021 5)均高于上述同时间点再灌注组(P<0.05)。

注：A：假手术组；B：缺血再灌注3 h组；C：缺血再灌注3 h + TMP组；D：缺血再灌注72 h组；E：缺血再灌注72 h + TMP组。 图 1 各组脑组织微血管中occludin蛋白的表达
2.3 微血管段occludin mRNA表达的变化(图 2)

在缺血侧脑组织occludin mRNA表达再灌注3 h组(0.424 3±0.046 1)和72 h(0.412 6±0.049 7)低于假手术组(0.874 5±0.053 8)(P<0.05)，川芎嗪治疗3 h组(0.693 2±0.031 7)和72 h组(0.675 3±0.038 6)均高于上述同时间点再灌注组(P<0.05)。

注：M：marker；1:假手术组；2:缺血再灌注3 h组；3:缺血再灌注3 h+TMP组；4:缺血再灌注72 h组；5:缺血再灌注72 h+TMP组 图 2 各组脑组织微血管中occludin mRNA的表达
2.4 Western blot法检测occludin蛋白表达的变化(图 3)

缺血侧脑组织occludin蛋白表达再灌注3 h组(0.154 9±0.021 3)和72 h组(0.133 6±0.024 5)缺血侧脑组织occludin蛋白表达明显低于假手术组(0.334 7±0.035 7)(P<0.05)，川芎嗪治疗3 h组(0.233 1±0.032 7)和72 h组(0.214 3±0.034 7)均明显高于上述同时间点再灌注组(P<0.05)。

注：A：假手术组；B：缺血再灌注3 h组；C：缺血再灌注3 h + TMP组；D：缺血再灌注72 h组；E：缺血再灌注72 h + TMP组。 图 3 各组脑组织微血管中occludin蛋白的表达
3 讨 论

BBB是维持中枢神经系统内环境稳定性的重要的结构和功能基础，BBB屏障功能的减弱及通透性增加可引起严重的血管源性脑水肿和其他并发症[8]。脑微血管内皮细胞之间形成的紧密连接(tight junctions，TJ)是大分子物质经细胞旁途径转运的屏障，是BBB的重要组成成分及保持BBB完整性的重要因素。Occludin是第一个被分离出来的组成紧密连接的膜蛋白[9]，它直接参与了紧密连接的细胞旁物质转运过程[10]，有研究证实Oclludin的结构和功能的变化直接影响TJ的状态[11]，是目前研究紧密连接的标志性蛋白。

本课题组前期研究发现大鼠BBB通透性在脑缺血再灌注后3 h和72 h明显增加[6]，此次研究提示在上述时间点伴随着occludin在缺血区脑组织微血管上分布的连续性和表达量均明显降低，这与Wang等[12]的研究结果一致，提示紧密连接蛋白occludin表达下调，与脑缺血再灌注后BBB通透性增加所导致的脑水肿密切相关。前期研究还证实再灌注3 h及72 h川芎嗪治疗组大鼠BBB通透性与同时间点再灌注组相比明显下降[6]，此次研究发现川芎嗪治疗组occludin在缺血区脑组织微血管上分布的连续性和表达与同时间点再灌注组相比有显著上调，提示川芎嗪可能通过上调紧密连接相关蛋白occludin的表达，诱导紧密连接关闭，恢复BBB的完整性和功能从而减轻脑水肿，进而达到保护受损脑组织的目的。

川芎嗪治疗脑缺血再灌注损伤的机制可能涉及到降低脑钙含量防止钙超载；清除自由基、减轻自由基的氧化损伤及抑制CIR神经元凋亡等机制[13, 14, 15]，本研究结果提示，川芎嗪可能通过上调紧密连接相关蛋白occludin的表达，降低BBB通透性，减轻血管源性脑水肿，为川芎嗪治疗脑缺血再灌注损伤提供了新的理论依据和研究靶点。

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