鞣花酸是一种在日常饮食中常见的多酚类植物化学物，主要存在于多种植物中,包括浆果、水果、坚果和蔬菜等^[1]。鞣花酸具有抗癌、抗氧化、抗炎、促进凝血、抑菌、抗疟原虫、保肝等生物学活性^[2]。作为日常饮食中常见的植物化学物质，鞣花酸通常被认为无毒，然而随着摄入量加大，鞣花酸潜在的毒性作用也随之显现。细胞毒性试验显示，鞣花酸对中国仓鼠B14细胞具有细胞毒性，浓度在60 μmol/L时使细胞存活率降到50%，同时，彗星试验显示鞣花酸处理中国仓鼠细胞细胞株B14及河蚌消化腺细胞后细胞DNA尾矩明显增加^{[3, 4]}，表明鞣花酸具有DNA损伤毒性作用，但毒性机制尚不清楚。本研究拟观察鞣花酸对HEK-293细胞DNA损伤作用及其氧化应激机制，为评估鞣花酸对人类健康潜在危害提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂

鞣花酸(美国Sigma-Aldrich公司)，纯度≥95%；抗8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxyderoxyguanosine,8-OHdG)单克隆抗体(日本JaICA公司)；Ultrasensitive TM S-P超敏试剂盒、辣根过氧化物酶显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；其他试剂均为国产或进口分析纯。 1.2 细胞分组与处理

HEK-293细胞用含10%胎牛血清及双抗的达尔伯克改良伊格尔(Dulbeccos modified eagle medium，DMEM)高糖培养液在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，选用对数生长期的HEK-293细胞，用0.25%胰酶进行消化，收集细胞，分别加入终浓度为30、60、120 μmol/L鞣花酸，同时设二甲基亚砜(dissolved in dimethyl sulfoxide，DMSO)溶剂对照组，37 ℃孵育1 h，细胞存活率经台盼蓝染色检测达>90%，Hoechst33342检测无凋亡现象发生，离心去上清，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)将细胞洗涤2次，重悬于PBS中，使细胞浓度最终达到1×10⁶个/mL。 1.3 指标与检测 1.3.1 DNA损伤检测

采用彗星试验，参照Singh等^[5]方法，略加改动。在激发波长549 nm,发射波长590 nm的荧光显微镜下阅片。每组随机选择50个细胞样本进行分析。利用CASP 1.2.2版软件测定彗星尾长(μm)、尾部DNA%、尾矩。 1.3.2 细胞内8-OHdG含量检测

采用免疫组化法，鞣花酸处理HEK-293细胞3 h后，收集细胞，用冷丙酮固定，依次滴加100 μg/mL RNAse A、0.1%Triton X-100、DNA 变性液，然后按照试剂盒步骤操作。反应结束后，滴加显色液，显微镜下观察，经梯度酒精脱水干燥后固定。显微镜下阅片，利用 Image-pro plus 4.5.1 图象分析系统进行定量图象分析，观察50个随机选择的细胞，用测得的吸光度值表示8-OHdG阳性表达的相对强弱。 1.3.3 细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)测定

按照苏莉等^[6]方法略加改动，选用荧光探针DCFH-DA(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate)检测HEK-293细胞内ROS水平。鞣花酸处理细胞1 h后，加入5 μmol/L DCFH-DA，37 ℃作用40 min后，用荧光分光光度计测定荧光强度。每次3个平行样，3次独立重复试验。 1.3.4 细胞内还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量测定

在5×10⁵个/mL细胞悬液中加入不同浓度鞣花酸作用1 h，然后加入0.4 mL 5%三氯乙酸，4 ℃下作用30 min，取离心后上清液50 μL，加PBS 0.8 mL和荧光剂邻苯二醛50 μL，37 ℃避光作用15 min。用荧光分光光度计测定荧光强度。每次3个平行样，3次独立重复试验。 1.4 统计分析

数据以x±s表示，采用SPSS 11.5进行统计分析，各组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 鞣花酸对HEK-293细胞DNA损伤影响(表 1)

彗星试验结果显示较低浓度(30~60 μmol/L)鞣花酸未引起细胞拖尾，而较高浓度(120 μmol/L)鞣花酸作用1 h后，HEK-293 细胞彗星样拖尾明显增长；120 μmol/L鞣花酸组细胞尾DNA%、尾长、尾矩均大于溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。 2.2 鞣花酸对细胞内8-OHdG表达水平影响 免疫组化结果显示，HEK-293细胞核的平均光密度值随着鞣花酸浓度增大而明显增强。溶剂对照组、30、60、120 μmol/L鞣花酸组细胞内8-OHdG表达水平分别为(74.6±3.16)、(77.47±1.29)、(114.62±3.20)和(121.69±4.36)；与溶剂对照组比较，60、120 μmol/L鞣花酸组8-OHdG表达水平明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)。

表 1

表 1 鞣花酸对HEK-293细胞DNA损伤影响(x±s，n=50) 组别(μmol/L) 尾部DNA%(%) 尾长(μm) 尾矩 溶剂对照组 2.59±1.21 3.06±0.32 0.08±0.04 鞣花酸 30 1.23±1.29 3.15±0.42 0.04±0.05               60 2.43±2.59 5.07±2.01 0.21±0.49               120 12.34±4.21a 20.76±3.59a 3.16±0.74a 注：与溶剂对照组比较，a P< 0.01。

表 1 鞣花酸对HEK-293细胞DNA损伤影响(x±s，n=50)

与溶剂对照组比较，30、60 μmol/L鞣花酸细胞内ROS及GSH水平无明显变化，120 μmol/L鞣花酸组细胞内ROS水平增高(P<0.01)，GSH水平降低(P<0.05)。

表 2

表 2 鞣花酸对HEK-293细胞内ROS、GSH水平影响(x±s，n=9) 组别(μmol/L) ROS GSH 溶剂对照组 7.43±1.77 4.78±0.49 鞣花酸 30 7.99±0.75 4.63±0.98               60 8.22±1.37 4.75±1.07               120 13.87±0.55b 3.22±0.38a 注：与溶剂对照组比较,a P<0.05，b P<0.01。

表 2 鞣花酸对HEK-293细胞内ROS、GSH水平影响(x±s，n=9)

植物化学物质具有广泛生物活性和促进健康及防治疾病作用，因此，植物化学物对人体健康的影响逐渐成为营养学研究热点。随着认识加深，逐渐发现一些植物化学物表现出双刃剑作用：低剂量具有促进健康作用，而高剂量表现出毒性作用。鞣花酸作为一种常见的植物化学物已被广泛应用于药品、食品及化妆品等领域。本研究结果显示，鞣花酸作用于HEK-293细胞1 h后，较低浓度(30、60 μmol/L)组未产生明显DNA拖尾现象，而120 μmol/L鞣花酸组细胞DNA迁移距离明显增加，引起细胞DNA损伤。提示低剂量鞣花酸未引起HEK-293细胞DNA损伤，而高剂量鞣花酸对HEK-293细胞具有DNA损伤毒性作用。

氧化损伤可由体内ROS产生过多和(或)抗氧化物质如GSH水平下降而产生。本研究结果显示，120 μmol/L鞣花酸作用于HEK-293细胞后引起细胞内ROS水平升高，同时细胞内GSH水平降低，氧化性损伤标志性产物8-OHdG增多。提示鞣花酸可破坏HEK-293细胞内氧化-抗氧化平衡，使细胞处于氧化应激状态，造成细胞DNA的损伤。