中国公共卫生  2013, Vol. 29 Issue (11): 1624-1626   PDF    
引用本文
宋金燕, 冯斐斐, 李娟, 王威, 姚武, 吴卫东, 吴逸明, 燕贞. 煤焦沥青烟提取物对THP-1细胞炎性因子表达影响[J]. 中国公共卫生, 2013, 29(11): 1624-1626.
SONG Jin-yan, FENG Fei-fei, LI Juan, et al. Effect of coal tar pitch smoke extracts on expression of inflammatory cytokines of THP-1 cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2013, 29(11): 1624-1626.
煤焦沥青烟提取物对THP-1细胞炎性因子表达影响
宋金燕, 冯斐斐, 李娟, 王威, 姚武, 吴卫东, 吴逸明, 燕贞     
郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室, 河南 郑州 450001
数字出版日期：2013-8-26 11:03
基金项目：国家自然科学基金(81001240;81001239)
作者简介：宋金燕(1984-),女,新疆伊犁人,硕士在读,研究方向:职业肿瘤。
通讯联系人：燕贞,E-mail:yanzhen@zzu.edu.cn
摘要：目的 探讨煤焦沥青烟提取物(CTPE)对人单核细胞株(THP-1)炎性因子表达的影响。方法 用2 μg/mL CTPE处理THP-1细胞24、48、72 h,并设立阴性对照组、二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组,real-time PCR检测各组细胞中白介素1β(IL-1β)、白介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清中TNF-α含量。结果 染毒CTPE 24 h时,染毒组IL-1β mRNA 表达水平为(2.22±0.33),均高于阴性对照组和溶剂对照组(P<0.05);染毒CTPE 72 h时,染毒组IL-8 和TNF-α mRNA 表达水平分别为(4.64±3.03)、(3.15±0.22),均高于阴性对照组和溶剂对照组(P<0.05);与对照组比较,染毒72 h时染毒组细胞培养上清中TNF-α含量[(538.44±53.88) pg/mL]升高,差异有统计学意义(P< 0.05)。结论 CTPE刺激单核细胞后可使TNF-α、IL-1β、IL-8表达水平增加。
关键词： 煤焦沥青烟提取物(CTPE)     肿瘤坏死因子-α(TNF-α)     白介素1β(IL-1β)     白介素8(IL-8)     单核细胞    
Effect of coal tar pitch smoke extracts on expression of inflammatory cytokines of THP-1 cells
SONG Jin-yan, FENG Fei-fei, LI Juan, et al    
Department of Occupational Health, College of Public Health, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan Province 450001, China
Abstract: Objective To explore the effect of coal tar pitch smoke extracts(CTPE)on the exprission of inflammatory cytokines in monocyte-macrophages(THP-1).Methods THP-1 cells were treated with or without 2 μg/mL CTPE(dimethylsulfoxide as vehicle) for different time(24,48,and 72 hours).The expression of interleukine 1-β(IL-1β),interleukine 8,IL-8) and tumor necrosis factor(TNF-α) mRNA were determined by real-time PCR.The release of TNF-α was determined using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results The expressions of TNF-α,IL-1β,and IL-8 mRNA of CTPE treatment groups were significantly different from those of the control group(P<0.05 for all).The expression level of IL-1β mRNA was 2.22±0.33 after treated with 2 μg/mL CTPE for 24 hours,while the IL-8 and TNF-α mRNA level were 4.64±3.03 and 3.15±0.22 for 72 hours,all of which were higher than those of control and blank groups(P<0.05).The release of TNF-α for 72 hours treatment group was 538.44±53.88 pg/mL,which was higher than that of other groups(P< 0.05).Conclusion CTPE could promote THP-1 cells to express TNF-α,IL-1β,and IL-8.
Key words: coal tar pitch smoke extract     TNF-α     IL-1β     TNF-α     IL-8     monocyte    

煤焦沥青(coal tar pitch,CTP)是炼焦工业产生的副产物，主要通过呼吸道对机体产生毒性反应[1]。流行病学调查和动物实验已经证实CTP具有致癌性[2]，其所致肺癌已被列为职业性肿瘤[3]。白介素1β(interleukine-1β,IL-1β)、白介素8(interleukine 8，IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)主要来源于单核巨噬细胞，当细胞受到毒素或炎症介质刺激时，可启动多条信号转导通路，导致机体发生炎性反应[4]。煤焦沥青烟提取物(coal tar pitch smoke extracts,CTPE)刺激THP-1细胞分泌炎性因子是否为职业接触CTP导致肺部炎症进而发展为肺癌的早期因素研究较少。本研究采用CTPE作为刺激物，通过观察CTPE对THP-1细胞炎性因子表达的影响，探讨CTPE致炎机制，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

CTPE(安阳钢铁公司焦化厂)，用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解[5]，1640培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，TNF-α酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(美国RD Biosciences公司)，反转录试剂盒(美国Fermentas公司)，Trizol试剂、PCR MastarMix(大连宝生物公司)，酶标仪(奥地利TECAN公司)，MX3000P Real-time PCR仪(美国Stratagene公司)。 1.2 细胞培养

单核细胞株(THP-1)(美国模式菌种收集中心)。细胞培养条件：用含胎牛血清体积分数为10%的1640培养液进行培养，隔天换液；培养环境：37 ℃ 恒温，CO2 5%，湿度95%。 1.3 分组与染毒处理

调整THP-1细胞浓度至1×105个/mL接种于60 mm培养皿中培养。实验设阴性对照组，DMSO溶剂对照组，CTPE染毒24、48、72 h组，染毒浓度为2 μg/mL。 1.4 指标与方法 1.4.1 细胞因子mRNA检测

采用Real-time PCR法，根据Genbank中的TNF-α、IL-1β、IL-8、β-actin的基因序列，用PP 5.0软件设计特异性引物(上海英骏生物技术有限公司合成)。引物序列：TNF-α上游：5′-CCCCAATCCCTTTATTACCC-3′，下游：5′-CGAAGTGGTGGTCTTGTTGC-3′；IL-1β′上游：5′-TTACAGTGGCAATGAGGATGAC-3′，下游：5′-TGTAGTGGTGGTCGGAGATT-3′；IL-8′上游：5′-TCAGAGACAGCAGAGCACACA-3′，下游：5′-ATCAGGAAGGCTGCCAAGAGA-3′；β-actin上游：5′-AAT-CTTGCGTGACATTAAGGAGAA-3′，下游：5′-CA-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′。染毒结束后收集细胞，参照Trizol试剂盒说明书提取THP-1细胞总RNA，取3 μg总RNA合成cDNA第一链，合成后进行PCR扩增。2×Taq PCR MastarMix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，用灭菌水补至20 μL。反应条件:IL-8预变性 95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；TNF-α、IL-1β预变性 95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s,56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，均重复40个循环，在72 ℃收集荧光信号(SYBR GreenⅠ)。以β-actin作内参照，采用2-ΔΔCt法计算各炎性因子mRNA表达量。 1.4.2 细胞培养液中TNF-α含量检测

采用ELISA试剂盒按照操作说明书检测各组细胞上清中TNF-α的含量。每样本设3个平行孔，在波长 450 nm检测，每次检测均做标准对照，并绘制标准曲线。 1.5 统计分析

采用SPSS 12.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用最小显著差法，检验水准α=0.05。 2 结 果 2.1 CTPE对THP-1细胞IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表达影响(表 1)

各组间IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。染毒24 h时，IL-1β mRNA表达水平最高，均高于阴性对照组及溶剂对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，TNF-α和IL-8 mRNA表达量在染毒72 h时最高，均高于阳性对照组、溶剂对照组及染毒24、48 h组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 CTPE对THP-1细胞炎症因子mRNA表达影响(x±s，n=3)
2.2 CTPE对THP-1细胞培养上清中TNF-α含量影响

结果显示，CTPE处理THP-1细胞 24、48、72 h时，细胞培养上清中TNF-α分泌量分别为(470.56±7.69)、(471.60±21.24)、(538.44±53.88) pg/mL，阴性对照组与溶剂对照组TNF-α分泌量分别为(434.18±10.20)和(440.09±12.63)pg/mL，组间比较差异有统计学意义(F=6.996，P<0.05)，其中72 h染毒组细胞培养上清中TNF-α的含量均高于阴性对照组、溶剂对照组及染毒24、48 h组，差异有统计学意义(P<0.05)。 3 讨 论

IL-1β、TNF-α和IL-8 是反映肺部炎症严重程度的重要指标，过度释放将使肺炎向重症发展[6]。研究显示，CTPE成分中多环芳烃类占所有成分的87.91%[7]，用CTPE刺激人支气管上皮细胞，导致人支气管上皮细胞在20代时染色体形态发生改变，30代细胞出现恶变，且恶变程度大于和恶变时间早于苯并芘处理组[8]，表明CTPE对细胞的毒性高于苯并芘。

在各种致炎细胞因子中，IL-1β和TNF-α是调节炎症的启动因素，抑制TNF-α和IL-1β 与周围靶细胞结合，可以减轻炎症反应。TNF-α是机体感染最关键的促炎症因子之一，可诱导其他致炎因子的合成和释放，参与恶性肿瘤的发生发展，组织中长期高水平的TNF-α可促进肿瘤的生长、侵袭和转移[9]。IL-1β是急性期免疫反应的主要调节因子，在炎症的初期出现，伴随着时间的推移而降低[10, 11]，IL-1β 也可能诱发TNF-α表达，在新生儿脑缺血缺氧性脑病研究中，脑脊液和血清中TNF-α的含量随着IL-1β的升高而升高[12]。IL-8是重要的中性粒细胞趋化因子，表达升高提示机体有炎症反应[13]。TNF-α和IL-1β能诱导IL-8启动子上调，增强过敏性炎症反应患者的肺内产生和释放IL-8[14]，诱发气道炎性反应。本研究结果显示，CTPE染毒24 h 时，THP-1细胞IL-1β mRNA表达水平最高，72 h时，细胞IL-8、TNF-α mRNA和蛋白表达水平最高。提示CTPE可刺激THP-1细胞TNF-α、IL-1β、IL-8等炎症因子水平上升，从而导致炎症反应。

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