支气管哮喘(简称哮喘)是以气道高反应性为基本特征的慢性非特异性气道炎症，其发病受遗传因素与环境因素的双重影响。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是体内重要的神经递质和免疫调节剂，广泛存在于嗜碱性粒细胞、血小板和肥大细胞等参与变态反应的炎症细胞中，介导一系列的细胞反应，包括细胞迁移、吞噬、分泌超氧化物和细胞因子等^[1]。以往研究发现，发作型哮喘患者血浆中5-HT水平明显高于无症状患者，与患者临床状态呈正相关而与肺功能呈负相关^[2]。一项临床双盲实验结果也显示，促5-HT吸收药物噻奈普汀通过降低5-HT水平抑制儿童哮喘的发作，并改善肺功能^[3]。近年研究显示，5-HT可促进鼠科哮喘动物模型气道变应性炎症、高反应性的发展和气道重构^[4]，提示5-HT可能在哮喘发生发展中起着重要的作用。机体内，5-羟色胺转运体(5-HT transporter,5-HTT) 负责将5-HT跨膜转运到各器官组织与受体结合发挥其功能。研究表明，5-HTT基因多态性可影响5-HT的表达^[5]。因此，5-HTT基因是研究5-HT相关疾病遗传易感性的一个重要候选基因。本研究采用以医院为基础的病例对照研究方法抽取2011年1月—2012年12月在广西百色地区右江民族医学院附属医院和百色市人民医院呼吸内科收治的188例壮族哮喘患者和同期在此2家医院进行健康体检的203名壮族体检者进行问卷调查和基因分型，探索该基因多态性与哮喘的关系，并分析基因多态性与哮喘社会心理影响因素之间的交互作用，旨在为哮喘研究提供新的遗传易感性标志。现将结果报告如下。 1 对象与方法 1.1 对象

将广西百色地区右江民族医学院附属医院、百色市人民医院呼吸内科收治的188例壮族哮喘患者作为病例组，以同期在此2家医院进行健康体检的203名壮族体检者作为对照组。全部调查对象均为在广西长期生活、三代均为壮族、未与其他民族通婚、相互之间无血缘关系，且签署了知情同意书的壮族居民。其中病例组患者均为按照中华医学会2008年支气管哮喘防治指南诊断标准^[6]确诊的哮喘患者；对照组患者为近1个月内无急性上呼吸道感染、胸部X线检查未见异常、无哮喘病史及典型过敏史者。 1.2 方法 1.2.1 问卷调查

(1)一般情况调查表：自行设计。内容包括性别、年龄、文化程度、婚姻状况、家庭人均月收入水平、居住地、哮喘家族史和吸烟情况等。吸烟指平均吸烟≥1支/d，持续吸≥1年^[7]；戒烟指完全停止吸烟并且不再吸烟^[8]。(2)激惹、抑郁和焦虑自评量表(Irritability,Depression and Anx-iety Scale,IDA) ^[9]：包括抑郁(5个条目)、焦虑(5个条目)、内向性激惹(4个条目)和外向性激惹(4个条目)共4个因子18个条目，每个条目相当于1个有关症状，按0~3分4级评分，其中3、4、6、7、8、9、10、11、14、15、16、18等12个条目按反向评分。其中抑郁因子得分<4分为正常，4~6分为边缘状态，>6分为异常；焦虑因子得分<6分为正常，6~8分为边缘状态，>8分为异常；内向性激惹因子得分<4分为正常，4~6分为边缘状态，>6分为异常；外向性激惹因子得分<5分为正常，5~7分为边缘状态，>7分为异常。(3)社会支持评定量表(Social Support Assessment Scale,SSAS) ^[10]：包括客观支持(3个条目)、主观支持(4个条目)和对支持的利用度(3个条目)共3个维度10个条目。其中第1～4和8～10题为单选题，选择1～4项分别记1～4分；第5题分A、B、C、D 4项计总分，每项从无到全力支持分别计1～4分；第6、7题回答“无任何来源”计0分，有几个来源计几分；总分等于各维度之和。得分越高提示个体得到的社会支持越多，对支持的利用度越好。(4)特质应对问卷(Trait Coping Style Questionnaire,TCSQ) ^[11]：包括消极应对(10个条目) 和积极应对(10个条目)共2个因子20个条目。每个因子从“肯定不是”到“肯定是”按1~5分5级评分，其中积极应对得分越高，表示个体处理负性情绪事件的能力越高；消极应对得分越高，表示个体处理负性情绪事件的能力越差。所有量表均由统一培训的调查员讲解填写要求后自行填写，填写完成后当场收回。 1.2.2 5-HTT基因多态性检测

采集研究对象静脉血2 mL，置于 EDTA 抗凝管中，采用离心柱型血液基因组 DNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取 DNA，样本留存于-80 ℃冰箱内备检。(1)位点的选择：在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)单核甘酸多态性数据库选择5-HTT基因功能性SNP，纳入标准为：①外显子区能改变氨基酸表达，在汉族人中最小等位基因频率(Minor Allele Frequency，MAF)>5%；②在非翻译区(untranslated regions，UTR)区，在汉族人中MAF>5%；③在5′启动子2 kb以内，在汉族人中MAF>5%。利用在线软件(http://snpinfo.niehs.nih.gov/)筛选与上述SNP可替换的tag SNP，tag SNP入选标准如下：上游2 kb，下游1 kb，MAF>5%，r²>0.8。最终入选的位点有rs140700、rs2020936、rs3794808、rs6352、rs25531。经文献检索，发现5-HTT基因启动子区域插入/缺失变异(5-HTT linked polymorphie region，5-HTTLPR)及第2内含子的1个短串联重复序列(Stin2位点)是已被广泛证实的功能位点^[5]，也纳入本研究。由于rs25531 位于5-HTTLPR 的近邻，有A/G 2种等位基因型，使5-HTTLPR成为三等位基因：LA、LG、S，实验证明LG和S 等位基因具有共显性等位基因作用，LG的存在减弱了L等位基因的功能，故LA等位基因为功能高表达，LG和S等位基因为低功能表达^[12]。(2)基因分型：rs140700、rs2020936、rs3794808、rs6352等4个SNP位点采用SNaPshot SNP分型技术进行分型。设计了4对PCR引物用于扩增了包含4个位点的4个152~249 bp片段，也设计了4个紧邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。利用Primer 3软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)进行在线引物设计，由上海天昊生物科技有限公司合成。PCR产物采用HotStarTaq(北京天根生化科技有限公司)进行多重PCR获得，PCR产物经虾碱酶(SAP)和外切酶I(EXO I)纯化后采用SNaPshot Multiplex kit(上海ABI公司)进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶(SAP)纯化后在ABI3130xl上样，最后用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)进行分型。 5-HTTLPR/rs2553三等位基因分型应用改良聚合酶链反应-限制性片段长度多态技术。采用Primer 3设计1对荧光PCR引物用于扩增5-HTTLPR/rs25531位点。引物rs25531位点PCR产物经限制性内切酶Msp I识别酶切位点酶切后，G等位基因产物会被切开，而A等位基因不被切开，缺失包含该位点的44 bp片段时，只显示PCR产物经过一次酶切后的产物长度；PCR产物经过酶切后形成不同大小的片段，最后通过ABI3130XL测序仪进行区分。Stin2位点分型采用荧光标记扩增产物长度多态分析方法。设计1对PCR引物，组成1个PANEL用于扩增1个多态位点，位点的荧光标记采用引物上标记5′FAM荧光标记，PCR产物稀释后取少量与内标标记混匀后直接上ABI3130xl进行毛细管电泳，数据文件采用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)进行分析。 1.3 统计分析

应用SPSS 13.0软件进行χ²检验、 t检验及单因素和多因素logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 一般情况

病例组188例壮族哮喘患者中，男性143例(76.06%)，女性45例(23.94%)；年龄18~82岁，平均年龄(42.56±11.85)岁；文化程度小学及以下35例(18.62%)，中学98例(52.13%)，大专及以上55例(29.26%)；未婚21例(11.17%)，已婚152例(80.85%)，离异或丧偶15例(7.98%)；家庭人均月收入≤2 000元171例(90.96%)，>2 000元17例(9.04%)；城镇居民95例(50.53%)，农村居民93例(49.47%)；有哮喘家族史者146例(77.66%)，无哮喘家族史者42例(22.34%)；从不吸烟者87例(46.28%)，吸烟者79例(42.02%)，戒烟者22例(11.70%)。对照组203名壮族体检者中，男性155人(76.35%)，女性48人(23.65%)；年龄22~85岁，平均年龄(42.56±11.85)岁；文化程度小学及以下5人(2.46%)，中学152人(74.88%)，大专及以上46人(22.66%)；未婚24人(11.82%)，已婚168人(82.76%)，离异或丧偶11人(5.42%)；家庭人均月收入≤2000元149人(73.40%)，>2 000元54人(26.60%)；城镇居民157人，农村居民46人；有哮喘家族史者185人(91.13%)，无家族史者18人(8.87%)；从不吸烟者114人(56.16%)，吸烟者24人(11.82%)，戒烟者65人(32.02%)。病例组与对照组比较，2组人群文化程度、家庭人均月收入、居住地、哮喘家族史和吸烟情况分布差异均有统计学意义(P<0.05)，性别、年龄和婚姻状况分布差异均无统计学意义(P>0.05)。 2.2 壮族人群5-HTT基因多态性与哮喘关联性(表 1)

由于rs6352位点只分出2种基因型，因此本研究未对该位点与哮喘的关联性进行分析。χ²检验结果显示，rs140700、rs2020936、rs3794808、rs25531、5-HTTLPR与Stin2等位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律。单因素logistic回归分析结果显示，rs3794808位点CC基因型个体哮喘发生风险为TT基因型个体的2.33倍(P=0.039)；在调整了性别、年龄、文化程度、婚姻状况、家庭人均月收入、居住地、哮喘家族史、吸烟情况等混杂因素后，多因素logistic回归分析结果显示，rs140700位点T等位基因携带者(CT+TT基因型个体)哮喘发生风险为CC基因型个体的2.14倍，rs2020936位点携带AG基因型个体和G等位基因携带者(AG+GG基因型个体)哮喘发生风险分别为AA基因型个体的1.94和1.74倍，rs3794808位点携带CC基因型个体哮喘发生风险为TT基因型个体的2.83倍(均P<0.05)。

表 1

表 1 壮族人群5-HTT基因各位点多态性与哮喘关联性 位点 基因型 病例组(n=188) 对照组(n=203) OR值 95%CI OR值a 95%CI a 例数 % 例数 % rs6352 TT 183 97.3 196 96.6 TG 5 2.7 7 3.4 rs140700 CC 149 79.2 168 82.7 1.00 TT 0 0.0 1 0.5 CT+TT 33 20.8 24 11.8 1.55 0.88～2.74 2.14 1.11～4.13 rs2020936 AA 128 68.1 153 75.4 1.00 AG 60 31.9 46 22.6 1.56 0.99～2.45 1.94 1.15～3.25 GG 0 0.0 4 2.0 AG+GG 60 31.9 50 24.6 1.43 0.92～2.23 1.74 1.05～2.88 rs3794808 TT 103 54.8 120 59.1 1.00 CT 65 34.6 73 36.0 1.04 0.68～1.59 1.37 0.84～2.23 CC 20 10.6 10 4.9 2.33 1.04～5.20 2.83 1.15～6.98 CT+CC 85 45.2 83 40.9 1.19 0.80～1.78 1.56 0.98～2.47 Stin2 12/12 146 77.6 146 71.9 1.00 10/12 31 16.5 52 25.6 2.20 0.75～6.49 3.35 0.95～11.84 10/10 11 5.9 5 2.5 0.60 0.36～0.98 0.66 0.37～1.17 10/12+10/10 42 22.4 57 28.1 0.74 0.46～1.16 0.86 0.51～1.45 5-HTTLPR/rs25531 S/S,LG/S,LG/LG 8 4.2 3 1.5 1.00 LG/LA,LA/S 30 15.9 45 22.2 0.69 0.41～1.15 0.60 0.46～1.57 LA/LA 150 79.8 155 76.3 2.76 0.72～10.58 4.72 0.97～20.62 注：a调整了性别、年龄、文化程度、婚姻状况、家庭人均月收入、居住地、哮喘家族史、吸烟情况等混杂因素后OR值及95%CI。

表 1 壮族人群5-HTT基因各位点多态性与哮喘关联性

本课题组前期调查结果表明，病例组抑郁、内向性激惹、消极应对、主观支持平均分分别为(7.42±3.13)、(5.70±3.85)、(25.80±4.70)、(20.80±5.95)分，均高于对照组的(4.22±1.99)、(3.17±2.10)、(23.23±6.01)、(25.31±5.59)分，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示抑郁、内向性激惹、消极应对和主观支持可能是哮喘发生的社会心理影响因素^[13]。本研究对5-HTT基因rs140700、rs2020936、rs3794808 3个位点多态性与抑郁、内向性激惹、消极应对、主观支持4个哮喘社会心理影响因素进行交互作用分析结果显示，5-HTT基因rs140700位点多态性与抑郁、主观支持及rs2020936位点多态性与内向性激惹均有交互作用(P<0.05)。

表 2

表 2 壮族人群5-HTT基因多态性与哮喘社会心理影响因素交互作用 交互项 β Sx Wald χ2值 P值 OR值 95%CI 抑郁×rs140700 0.36 0.05 49.08 0.001 1.44 1.30～1.59 内向性激惹×rs2020936 0.10 0.04 5.61 0.018 1.10 1.02～1.20 主观支持×rs140700 -0.10 0.01 30.67 0.001 0.93 0.91～0.95 常数项 -0.90 0.39 5.43 0.020 0.40

表 2 壮族人群5-HTT基因多态性与哮喘社会心理影响因素交互作用

在哮喘发病机理中，5-HT主要是通过抑制IL-12活性和促进肺泡巨噬细胞分泌前列腺素-2来调节肺内细胞因子网络而起作用，其发挥作用的机制可能是作为一种化学引诱物促进嗜酸细胞的交换和迁移^[4]。5-HTT作为5-HT高度亲和的跨膜转运蛋白，在外周介导血小板摄取5-HT进入致密颗粒，对外周5-HT效应的调节起着关键作用。人类5-HTT由单基因编码(SLC6A4)，位于17q11.1-17q12区，有关5-HTT基因多态性与哮喘关系的报道较少。探讨5-HTT基因多态性与哮喘的关系，有助于深入了解5-HT在哮喘发生发展中的作用机制，并为哮喘临床防治提供依据。

本研究通过生物信息学软件，筛选多个5-HTT基因具有潜在功能的多态性位点。其中，rs140700、rs2020936、rs3794808等位点多态性可能导致氨基酸的替换而影响5-HTT蛋白的表达。而5-HTTLPR和Stin2多态为5-HTT基因最常见的2个功能性多态位点，其通过影响5-HTT基因的转录活性对5-HT的摄取产生影响^[5]。本研究利用广西壮族聚居地作为研究现场，研究发现，rs140700、rs2020936、rs3794808等位点多态性可能与哮喘发生风险有关，而三等位基因5-HTTLPR/rs25531和Stin2等位点多态性与哮喘发生风险无关。王岚等^[14]研究发现，哮喘发生风险与Stin2位点多态性有关，而与5-HTTLPR多态性无关。但是，王岚等^[14]研究中的调查对象均为汉族人群，提示5-HTT基因多态性可能存在民族差异性。以往研究显示，5-HTT基因多态性可能与抑郁^[15]、骨质疏松症^[16]、慢性阻塞性肺部疾病^[17]、早发心肌梗死^[5]等多种疾病有关，表明5-HTT基因这些多态性位点具有复制的生物学作用，其具体生物学功能需要进一步的探索。

哮喘属于心身疾病已在学术界达成普遍的共识，研究表明机体社会心理应激，可影响下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，从而诱发哮喘或加重哮喘^[18]。本研究发现5-HTT基因rs140700位点多态性与抑郁、主观支持及rs2020936 位点多态性与内向性激惹均有交互作用，证实了哮喘是遗传-环境因素共同作用的一个复杂性疾病。值得注意的是，5-HTT基因多态性与抑郁发生风险的关系在多地区和人群中均得以证实。因此，抑郁是否作为基因多态性、哮喘发生风险病因链中的一个中间变量存在尚有待进一步研究。

综上所述，5-HTT基因rs140700、rs2020936、rs3794808等位点多态性可能是壮族人群哮喘发病的潜在遗传易感性标志，其功能及其与抑郁、主观支持、内向性激惹的交互作用在哮喘发生发展中的作用有待进行下一步研究予以阐明。