水环境中存在100多种威胁人类健康的血清型病毒，因饮用水污染病毒引起传染病的暴 发流行屡见不鲜^[1]，受到广泛关注。自然水体特别是饮用水中，病毒含量极低，病毒的浓缩 成为检测水病毒的关键。大肠杆菌噬菌体f2噬菌体属无包膜单链RNA病毒，直径为22～ 26 nm^[2]，其物理、化学性质及对外界环境耐力与脊髓灰质炎病毒等相似，检测方法简便， 对人不致病。已有人建议将f2噬菌体作为肠道病毒的指示物^{[3, 4]}。浓缩水体病毒方法多样， 其中超滤法可用于污水处理、制备纯水和实验室病毒浓缩^[5]，但鲜见于大体积地表水的病毒 浓缩。本实验采用直径10 nm的超滤膜，建立反冲式闭路浓缩系统，进行f2噬菌体回收实 验并评价浓缩效果，旨在建立一种适用于地表水、饮用水的病毒浓缩方法。 1 材料与方法 1.1 材料

大肠埃希菌f2噬菌体，宿主菌E.coli 285株，均由同济医学院环境医学研究所提供。 1.2 主要仪器与试剂

外压式中空纤维超滤膜(切割分子量10万dalton，内径10 nm，改性聚氯乙烯膜材质；艾科滤膜技术有限公司)；实验装置实验室自行设计；不锈钢电热蒸馏水器(上海三申医疗器械有限公司)自制单蒸水；营养肉汤培养基，营养琼脂培养基(1%和2%)；285菌悬液(同济医学院环境医学研究所)。 1.3 方法

(1)水样：自制单蒸水按实验需水量及实验设计要求控制温度及pH，人工接种一定量的f2噬菌体。(2)水样浓集：按三因素三水平的正交实验安排实验条件，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl调节模拟水样pH，控制水样温度和超滤膜仪器的透膜压差，将人工添加有f2噬菌体的2 L水样通过U型外压式中空纤维超滤膜装置。水样在流速≥0.5 L/min的水泵的作用下从进水口通过该超滤膜，之后以1 L单蒸水反冲超滤膜得反冲液。经正交试验选择较优化条件后，用10 L模拟水样循环浓缩：原水以约40%比例滤出，其余部分回流到原水进行循环，完成浓缩后分别得到浓缩液和出水。待浓缩液体积减至200 mL左右时停止循环，用1 L单蒸水反冲，收集反冲液。(3)噬菌体的检测：在原水、浓缩液、出水、反冲液中各取5 mL水样，用双层琼脂法检测其中f2噬菌体的含量^[6]：将各水样分别取1 mL用无菌蒸馏水作10倍系列稀释，取不同稀释度稀释液1 mL、285菌悬液(同济医学院环境医学研究所提供)0.2 mL和约45 ℃的半固体营养琼脂5 mL，混匀器混匀，倒入装有固体营养琼脂培养基的平皿中，冷却，将平皿倒置于37 ℃ CO₂培养箱中培养12～24 h。观察透明空斑并计数确定其空斑形成单位(Plaque forming unit，PFU)。计算其回收率。f2噬菌体回收率= (浓缩液中f2噬菌体数量+反冲液中f2噬菌体数量)/原水中f2噬菌体数量×100%。 1.4 统计分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。 2 结 果 2.1 L₉(3⁴)正交设计表

三因素三水平的正交实验的设计采用标准L₉(3⁴)正交设计表^[7]，将因素A、B、C分别安排在正交表的第1、2、3列上。不考虑A、B、C 3个因素的交互作用安排实验。操作压力和温度均为超滤产水效果的影响因素，本实验选取操作压力分别为0.25、0.3和0.4 MP；所选温度代表水环境四季的温度，即4、25和30 ℃；pH取值在f2噬菌体存活范围内，分别选取酸性、中性和碱性的水环境，即pH 3.5、7.0和9.5。正交实验实施时按照因素顺序上列、水平对号入座，实验横着做。 2.2 直观分析法(表 1)

实验中人工接种f2噬菌体浓度为10³~10⁴ PFU/mL，总回收率的计算公式见上述方法。表 1中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别表示每个因素各水平下的总和，R为各因素各个水平平均回收率的极差。结果显示，正交实验因素的主次顺序为C、A、B，即压力与pH值为影响实验中f2噬菌体回收率的主要因素，而温度影响次之。实验最佳搭配为A₂B₁C₂，即压力0.3 MP、温度4 ℃、pH 7.0时效果最佳。由于B因素为次要因素，可以根据实际情况选取适当水平。

表 1

表 1 超滤膜浓缩f2噬菌体回收实验结果 实验 编号 A因素 压力(MP) B因素 温度(℃) C因素 pH f2噬菌体 回收率(%) 1 1 1 1 11.5 2 1 2 2 94.5 3 1 3 3 57.0 4 2 1 2 94.6 5 2 2 3 59.6 6 2 3 1 81.9 7 3 1 3 88.0 8 3 2 1 34.5 9 3 3 2 40.9 Ⅰ 1.630 1.941 1.279 Ⅱ 2.361 1.886 2.300 Ⅲ 1.634 1.798 2.046 R 0.244 0.048 0.341

表 1 超滤膜浓缩f2噬菌体回收实验结果

选取压力0.3 MP、pH 7.0、室温25 ℃条件进行10 L水样循环浓缩f2噬菌体的回收实验。10 L水样进行循环浓缩直至浓缩液量达200 mL左右时，停止循环进行反冲，测得f2噬菌体的总回收率达86.3%～113.7%。

表 2

表 2 10 L水样循环浓缩f2噬菌体的回收效果 实验 次数 原水中浓度 (PFU/mL) 浓缩液回 收率(%) 反冲液回 收率(%) 总回收率 (%) 1 1 245 2.5 111.2 113.7 2 1 480 3.6 82.7 86.3 3 1 350 6.1 99.5 105.6

表 2 10 L水样循环浓缩f2噬菌体的回收效果

目前水体病毒的富集方法常见的主要包括絮凝沉淀、膜吸附洗脱、免疫磁珠法等。利用 多价阳离子盐，如Ca²⁺、Al³⁺等来沉淀浓缩病毒效果虽好，但只能处理有限量的水体，因而 应用范围有限^{[8, 9]}。膜吸附洗脱法运用带电荷滤膜吸附性来吸附病毒，然后用蛋白质类或改 变多价阳离子吸附特性的物质进行洗脱从而回收病毒。刘军义等^[10]用阳电膜过滤法浓缩水 中f2噬菌体，其回收率<50%。徐礼源等^[11]用免疫磁珠法对f2噬菌体进行吸附洗脱也取得 一定的效果，但需理想的微磁珠与免疫配体相结合，洗脱解离效率偏低影响病毒回收率。李 君文等^[12]认为回收率>100%可能与f2噬菌体的多聚团解聚有关。

本实验改变相关实验条件，2 L水样单次不循环回收结果差异无统计学意义，即在选定 试验条件下压力、水样温度及pH对浓缩结果无明显影响。在优化条件下，增大水样体积至 10 L，循环浓缩f2噬菌体，总回收率可达86.3%～113.7%。实验中随着循环次数的增多，浓 缩液体积逐渐减少，浓缩液中f2噬菌体的浓度有所增加，回收率却<10%，增加反冲后，总 回收率可达到86.3%。净化或浓缩过程中颗粒物会堵塞滤孔降低滤过效果。增加反冲功能有 效减少堵塞，提高了浓缩效果。反冲超滤法用来浓缩水体病毒简单易行，不需对水样进行复 杂预处理，且能处理较大水样量，可为水体病毒的浓缩提供一个简便快速高效低成本的方法。