食品过敏是过敏性疾病的一种，可能导致严重的过敏症状，随着食物供应的日益丰富，食品过敏的发生也越来越多。流行病学调查结果表明，近年来过敏症的发病率呈逐年上升的趋势，发达国家每年有3%～4%的成年人发生食品过敏，儿童及婴幼儿的发病率为5%^{[1, 2]}。可靠、精确地评价食物中的过敏原对于预防食物过敏非常重要。本研究利用动物模型和生物信息学分析方法对3种外源蛋白(Cry1Ab/Ac、LRP和HSA)的潜在致敏性进行分析，旨在为食物蛋白致敏性评价提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物与受试蛋白

3周龄SPF级雌性BALB/c小鼠32只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，许可证号：SCXK(京)2006-0009。本实验所用的3种外源蛋白均为转入水稻作物中的蛋白，分别为高赖氨酸蛋白LRP、药用蛋白人血清白蛋白HSA和抗虫蛋白Cry1Ab/Ac。其中，LRP是大翼豆的一种赖氨酸敏感储存蛋白，Cry1Ab/Ac是一种苏云金芽胞杆菌的晶体蛋白。LRP和Cry1Ab/Ac是利用BL21大肠杆菌表达，载体由实验室先前构建，使用His TrapTMFF凝胶柱进行纯化。HSA由武汉大学杨代常实验室赠送。 1.2 主要试剂与仪器

生物素标记的大鼠抗小鼠IgE抗体(英国Abcam公司)，HRP标记的链霉亲和素(美国Thermo Scientific公司)，小鼠组胺试剂盒(美国 Cusabio Biotech公司)，胃蛋白酶(美国Sigma公司)，乳球蛋白、牛血清白蛋白(美国Sigma公司)；N06355光谱扫描多功能读数仪(美国伯乐公司)。 1.3 动物分组与处理

将实验动物随机分为对照组、Cry1Ab/Ac组、LRP组、HSA组，每组8只。SPF级环境饲养，自由进食和饮水，室内温度(22±1)℃，相对湿度55±5%。实验前动物适应性喂养1周。实验持续6周，每周监测动物的一般状况。实验开始第0、7、14、21和28 d Cry1Ab/Ac组、LRP组、HSA组小鼠分别经口灌胃Cry1Ab/Ac、LRP、HSA蛋白 1 mg/只(蛋白溶解于100 μL生理盐水)，第42 d大剂量灌胃刺激动物，剂量为 10 mg/只；阴性对照组使用相同体积的生理盐水灌胃。 1.4 检测指标与方法 1.4.1 特异IgE抗体检测

在试验前1 d、第35 d采血，4 ℃ 4 000 r/min离心5 min，分离血清，保存于-20 ℃以备之后特异性IgE水平的测定。采用间接ELISA法测定，将受试蛋白分别用包被缓冲液(0.05 M Na₂CO₃，pH 9.6)稀释至10 mg/L，在 96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100 μL，4 ℃过夜。0.1% Tween 20-磷酸盐缓冲液洗涤3次后，加入150 μL 1%BSA-磷酸盐缓冲液在37 ℃下封闭1 h。之后重复洗涤步骤3次。加入不同稀释度的动物血清，在37 ℃下孵育1 h。重复洗涤步骤5次，每孔加入100 μL生物素标记的大鼠抗小鼠IgE抗体(稀释度1∶2 000)在37 ℃下孵育1 h。重复洗涤步骤6次，每孔加入100 μL HRP标记的链霉亲和素(1∶4 000稀释)，37 ℃下孵育1 h。每孔加入100 μL TMB显色液，37 ℃下显色15 min后，每孔加入50 μL 2N的硫酸终止液，在450 nm波长下读取A值。致敏前1 d的血清作为试验的阴性对照，以阴性对照各孔的平均吸光度加上3倍标准差作为参考值。将测试血清倍比稀释，高于参考值的最小稀释度即为特异性抗体滴度。 1.4.2 组胺检测

在第42 d大刺激20 min后，使用含有EDTA-K2的离心管收集抗凝血，4 ℃ 4 000 r/min离心5 min分离血浆，保存于-20 ℃以备组胺测定。采用ELISA试剂盒进行测定，将各种试剂移至室温(18~25 ℃)平衡至少30 min，配置试剂，备用。设标准孔和待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100 μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37 ℃温育2 h后弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，37 ℃温育1 h后弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，200 μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴， 37 ℃温育1 h后弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，200 μL/每孔，甩干；然后依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光显色15~30 min。再依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的A值。 1.5 生物信息学分析

通过在线致敏原数据库(The Allergen Online Database)进行蛋白质序列同源性比对。(1)全长比对：将待测蛋白质氨基酸序列与数据库中已知过敏原序列进行全长比对，E值≤0.01则待测蛋白质与已知过敏原具有较高的序列同源性。(2)80个氨基酸序列比对：将待测蛋白质氨基酸序列中每80个氨基酸序列作为一个序列单位与数据库中已知过敏原序列进行比对；若其中一段或几段80个氨基酸序列与已知过敏原的序列同源性≥35%，则待测蛋白质与已知过敏原具有较高的序列同源性。(3)8个连续氨基酸比对：将待测蛋白质氨基酸序列与数据库中已知过敏原序列进行比对，如果待测蛋白质氨基酸序列与已知过敏原具有完全匹配的8个连续氨基酸，则待测蛋白质与已知过敏原具有较高的序列同源性^[3]。 1.6 统计分析

实验数据采用±s表示，应用SPSS 13.0软件进行统计分析。组间比较采用方差分析，方差齐时两两比较采用LSD-t检验，方差不齐时两两比较采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 特异性IgE抗体和组胺水平(表 1)

不同组别小鼠比较，Cry1Ab/Ac组、LRP组、HSA组小鼠IgE抗体水平均高于对照组小鼠(P＜0.05)，但3组小鼠IgE抗体水平差异均无统计学意义(P＞0.05)；对照组、Cry1Ab/Ac组、LRP组、HSA组小鼠组胺水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表 1

表 1 不同组别小鼠特异性IgE抗体和组胺水平比较(x±s，n=8) 组别 IgE抗体 组胺(pg/mL) 对照组 1.67±0.58 976.46±179.55 Cry1Ab/Ac组 3.83±0.41 1308.56±465.17 LRP组 3.00±0.00 985.89±453.54 HSA组 3.50±0.55 1149.61±200.97

表 1 不同组别小鼠特异性IgE抗体和组胺水平比较(x±s，n=8)

生物信息学分析结果显示，未发现Cry1Ab/Ac与已知过敏原有同源性；LRP和HSA全长氨基酸序列分析、80个连续氨基酸序列分析和8个连续氨基酸分析均与已知过敏原有同源性，可能存在潜在致敏性。 3 讨 论

在过去几十年中，科学界加强了对转基因食物潜在安全性问题的关注^[4]，特别是对外源蛋白致敏性和毒性的研究^{[5, 6]}。近年来，外源蛋白的安全性评价越来越受到人们的重视。动物模型是近年来发展的评价食物过敏性的新方法，是评价其潜在致敏性最直接的方法之一^[7]；适宜于过敏性评价的动物模型暴露于人类过敏原后均能产生过敏反应^[8]。生物信息学分析是通过序列相似性的比较分析来判定该外源蛋白是否具有潜在致敏性的最简单快捷的方法。若外源蛋白的基因编码的氨基酸序列同已知致敏原的序列相似，则可以预测该外源蛋白存在潜在致敏性。

本研究通过动物模型以经口灌胃途径给予Balb/c小鼠Cry1Ab/Ac、LRP和HSA 3种外源蛋白，采用ELISA法测定血清中特异性IgE抗体水平和血浆中组胺水平，实验结果显示这3种外源蛋白均存在较强的免疫原性，但尚未诱发组胺水平的明显升高，即不会诱发动物的过敏症状。本研究还利用信息学分析方法判断3种外源蛋白的潜在致敏性，结果显示HSA和LRP与已知的食品过敏原存在同源性，因此存在潜在致敏性，而Cry1Ab/Ac未与已知的食品过敏原存在同源性，因此可能不具有潜在致敏性。提示生物信息学分析与动物模型试验对于这3种外源蛋白的致敏性分析结果存在差异，提示不同的分析手段可能会得出不同的实验结果，因此对于外源蛋白的致敏性评价需要更多的研究。