抗生素由于广泛用于牲畜的疾病预防、治疗和促进动物生长，从而导致其在动物性食品和奶中残留。尽管中国明文规定禁止残留抗生素的奶在市场销售，但近年来仍有在市售牛奶中检出抗生素残留的报道^{[1, 2]}。低浓度的残留不一定造成急性毒性，但可能会对人体肠道菌群造成影响；牛奶是婴儿的主要食物，婴儿肠道菌群中双歧杆菌、乳杆菌是公认的2株益生菌，其对抵御外来致病菌侵袭，防止婴儿腹泻有重要作用^[3]。为此，本研究于2008—2010年采用体外模拟胃肠道培养系统研究牛奶中残留的青霉素、链霉素和磺胺类抗生素对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标准菌株

婴儿双歧杆菌(CICC 6069)、嗜酸乳杆菌(CICC 6075)(北京中国工业微生物菌种保藏管理中心)。 1.1.2 主要仪器与试剂

AG285型电子天平、HPX-9162MBE型数显电热培养箱、YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器、无菌工作室(上海博迅实业有限公司)；101-2型电热恒温干燥箱(浙江省嘉兴县新勝电热仪器厂)。MRS琼脂培养基、胆盐乳糖琼脂(BL)培养基(分别用于嗜酸乳杆菌和双歧杆菌分离培养，上海盛思生化科技有限公司)；标准品:氨苄青霉素(上海贝基生物科技有限公司)；硫酸链霉素、磺胺间甲氧嘧啶(北京上立方联合化工技术研究院)；胃蛋白酶、胰酶、胆盐(上海连冠生物化工有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 胃液、肠液的配制

参照中华人民共和国药典^[4]。 1.2.2 体外模拟残留药物经胃肠系统作用实验^{[5, 6]}

分别围绕牛奶中抗生素的残留限量标准设置浓度，配制不同抗生素残留浓度组的牛奶溶液，抗生素浓度从0、2、4、6、8 μg/L组直到0、10、20、30、40 mg/L组，各组取含不同浓度抗生素的牛奶，加胃液，调节pH值为3~4，37 ℃孵育2 h，然后加肠液，调节pH为7，混合物37 ℃孵育2 h，分别接种适量含婴儿双歧杆菌或嗜酸乳杆菌标准菌株的菌液，混匀。混合液37 ℃厌氧孵育20 h。为观察孵育后细菌数量变化,于接种菌液后0 h和孵育20 h后分别取混合液接种于BL、MRS琼脂培养基平皿，厌氧培养48 h后计数孵育前后菌落数；通过与对照组比较孵育后菌落计数数量上的变化，决定细菌生长是否受影响。平皿计数采用Photoshop CS4的计数工具进行计数，结果乘以稀释倍数得到孵育液中的菌落总数。 1.3 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。细菌菌落计数资料符合Possion分布，当计数足够大时用两计数的u检验法进行检验^[7]，检验水准α= 0.05。 2 结 果 2.1 氨苄青霉素残留对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌标准菌株生长影响(表 1)

当牛奶中氨苄青霉素浓度为2 μg/L时，即见到嗜酸乳杆菌菌株在本离体肠道模拟系统中的生长受到抑制，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，并存在剂量效应关系(r=-0.9240,t_r=4.1853,P<0.05),即随氨苄青霉素浓度增加，抑菌作用逐渐增强。而婴儿双歧杆菌菌株在本离体肠道模拟系统中，当浓度在0～80 μg/L 范围内均未见明显生长抑制作用，但在浓度100 μg/L组开始婴儿双歧杆菌菌株的生长受到明显抑制，与对照组比较差异有统计学意义(P<.01)，并存在明显剂量效应关系(r=-0.986 5，t_r=12.05，P<0.01)。

表 1

表 1 牛奶中不同氨苄青霉素浓度对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长影响 组别 药物浓度 (μg/L) 婴儿双歧杆菌 药物浓度 (μg/L) 嗜酸乳杆菌 平皿计数 (cfu/皿) 菌落总数 (cfu/mL) u值 P值 平皿计数 (cfu/皿) 菌落总数 (cfu/mL) u值 P值 对照组 0 451 2.25×107 0 577 2.89×108 氨苄青霉素组 100 285a 1.43×107 9.15 <0.01 2 494a 2.47×108 2.52 <0.05 200 300a 1.50×107 5.49 <0.01 4 432a 2.16×108 4.57 <0.01 300 171a 8.60×106 11.21 <0.01 6 317a 1.59×108 8.70 <0.01 400 109a 5.45×106 14.43 <0.01 8 200a 1.0×108 13.51 <0.01 500 91a 4.60×106 15.44 <0.01 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 1 牛奶中不同氨苄青霉素浓度对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长影响

浓度为100～500 μg/L硫酸链霉素组与对照组比较，对孵育液中婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌标准菌株生长均无抑制作用；而当浓度在10～40 mg/L范围时随着牛奶中硫酸链霉素浓度增加，孵育液中婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌标准菌株计数明显降低，在浓度≥20 mg/L时与对照组比较，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，表明当硫酸链霉素浓度为20 mg/L时开始对婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌标准菌株的生长有抑制作用。分别对这2种菌在0～40 mg/L浓度范围的平皿计数进行直线相关分析，其中，婴儿双歧杆菌中

硫酸链霉素的浓度与平皿计数呈负相关(r=-0.992，P＜0.05)；嗜酸乳杆菌中硫酸链霉素的浓度与平皿计数呈负相关(r=-0.943，P＜0.05)，表明随着硫酸链霉素浓度增高，抑菌作用逐渐增强，存在剂量效应关系。

表 2

表 2 牛奶中不同浓度硫酸链霉素对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长影响 组别 药物浓度 (μg/L) 婴儿双歧杆菌 嗜酸乳杆菌 平皿计数 (cfu/皿) 菌落总数 (cfu/mL) u值 P值 平皿计数 (cfu/皿) 菌落总数 (cfu/mL) u值 P值 对照组 0 174 8.7×107 598 3.0×108 硫酸链霉素组 10 153 7.7×107 1.13 ＞0.05 672a 3.4×108 2.08 ＜0.05 20 127a 6.4×107 2.68 ＜0.05 429a 2.1×108 5.26 ＜0.05 30 93a 4.2×107 4.93 ＜0.05 183a 9.2×107 14.83 ＜0.05 40 54a 2.7×107 7.91 ＜0.05 31a 1.6×107 22.59 ＜0.05 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 2 牛奶中不同浓度硫酸链霉素对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长影响

磺胺间甲氧嘧啶仅在浓度为800 μg/L时婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌计数与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，表明≥800 μg/L才可能对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长有抑制作用。

表 3

表 3 牛奶中不同浓度磺胺间甲氧嘧啶对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长影响 组别 药物浓度 (μg/L) 婴儿双歧杆菌 嗜酸乳杆菌 平皿计数 (cfu/皿) 菌落总数 (cfu/mL) u值 P值 平皿计数 (cfu/皿) 菌落总数 (cfu/mL) u值 P值 对照组 0 111 5.6×107 80 4.0×108 磺胺间甲氧嘧啶组 500 99 5.0×107 0.79 >0.05 85 4.3×108 0.35 >0.05 600 94 4.7×107 1.15 >0.05 75 3.7×108 0.36 >0.05 700 91 4.6×107 1.37 >0.05 62 3.1×108 1.47 >0.05 800 79a 4.0×107 2.29 <0.05 56a 2.8×108 2.02 <0.05 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 3 牛奶中不同浓度磺胺间甲氧嘧啶对婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌生长影响

在对食品中抗生素残留进行安全性评价时，建立每日允许摄入量和食品中最高残留限量值，应该考虑当前公共卫生所关注的微生物学方面的问题，包括破坏肠道定植屏障和耐药性菌株的产生两方面。因此，本研究在牛奶中加低浓度抗生素，与模拟胃肠液孵育，目的是探索在经过胃肠液作用后残留量的抗生素是否对肠道细菌生长有影响。本研究结果显示，硫酸链霉素和磺胺间甲氧嘧啶对婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌产生影响的浓度远大于中国农业部颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》^[8]牛奶中允许的最高残留限量值，表明目前制定的标准对这2种菌株的生长是安全的。而当氨苄青霉素在2 μg/L时有抑制嗜酸乳杆菌生长的作用，该值远低于中国农业部颁布的牛奶中氨苄青霉素的最高残留限量值 10 μg/kg^[8]。双歧杆菌、乳杆菌是婴儿肠道的重要益生菌，能明显抑制致病菌的粘附和定植，对婴儿肠道健康具有重要作用^{[9, 10]}。但是在低于国家制定的最高残留限量值时，已经观察到氨苄青霉素有抑制其生长的作用。因此在今后制定氨苄青霉素的每日允许摄入量和修订牛奶中氨苄青霉素的最高残留限量值时，有必要考虑对这些肠道菌群的影响。