胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在其复杂的发生发展过程中，胃肠激素发挥着重要作用。蛙皮素(bombesin,BN)是一种含14个氨基酸残基的胃肠激素，在人的食道、胃肠道和胰腺均有广泛表达^[1]。作为自分泌或旁分泌生长因子，BN可以促进各类细胞特别是肿瘤细胞的增殖^{[2, 3]}。然而，有关BN在胃癌发生发展过程中的动态变化及其临床意义尚不清楚。本研究采用免疫组化法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测BN在对照组、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、不典型增生及胃癌组织中的表达水平，探讨BN作为胃癌及其癌前疾病(病变)的生物学标志物的价值，进而为临床工作中监测和诊断胃癌及其癌前疾病(病变)提供实验基础。 1 对象与方法 1.1 对象

2011年5月—2012年12月在沈阳医学院奉天医院内窥镜中心接受胃镜检查者和部分手术患者(术前均未进行放、化疗等特殊治疗)的胃黏膜组织94例，其中癌旁基本正常胃黏膜10例(对照组)，浅表性胃炎28例，萎缩性胃炎21例，胃黏膜不典型增生17例，胃癌18例。上述组织样品，经病理学诊断。全部病例中，男性49例，女性45例，平均年龄为50.40岁(21~79岁)，各组间在性别及年龄构成上差异均无统计学意义。 1.2 主要实验试剂与仪器

兔抗人BN抗体(美国 abcom公司)；PV超敏试剂盒和浓缩型DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒和Marker(大连宝生物工程有限公司)；BN引物(北京三博远志生物技术公司)；梯度PCR仪(德国Eppendorf Mastercycler公司)，DYY-BC电泳仪(北京市六一仪器厂)。 1.3 免疫组化染色

BN为即用型兔抗人抗体，稀释比1:100，按PV超敏试剂盒程序染色，DAB显色。以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)替换一抗做为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。 1.4 BN的RT-PCR检测

参照试剂盒说明书及王素青^[4]方法操作，BN上游引物：5′-ACTGGGCGGTGGGGCACTTAAT-3′、下游引物：5′-TCCTCTTGTCTTTGGTGGTCGGTGG-3′，产物169 bp，Gel-pro Analyzer PCR软件进行图像分析，结果以BN/β-actin的整合光密度(integrated density value,IDV)比值表示。 1.5 统计分析

采用SPSS 13.0软件对实验数据进行统计分析，所有数据以(x±s)表示，多组间采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 免疫组化法检测BN的表达(图 1、表 1)

BN蛋白免疫反应阳性颗粒为棕黄色，主要表达在细胞膜和细胞质，细胞核无着色。在对照组、浅表性胃炎和萎缩性胃炎黏膜组织中，呈散在分布，着色浅，表达量低；在胃黏膜不典型增生组织和胃癌组织中，分布广泛，着色深，表达量高。各组的平均光密度值(Mean optical density,MOD)见表 1。

图 1

注：A：对照组；B：浅表性胃炎；C：不典型增生；D：胃癌。 图 1 胃黏膜组织蛙皮素表达(免疫组化法染色，×200)

表 1

表 1 蛙皮素在各组中的表达水平 组织类别 组化 样本数 MOD值 (±s) RT-PCR 样本数 IDV值(±s) 对照 10 0.125 9±0.024 8 8 0.105 6±0.029 7 浅表性胃炎 28 0.131 8±0.037 1 12 0.110 0±0.037 1 萎缩性胃炎 21 0.111 4±0.019 4 10 0.091 4±0.021 3 不典型增生 17 0.338 7±0.046 5abc 10 0.301 7±0.062 5abc 胃癌 18 0.394 6±0.062 1abc 12 0.695 8±0.072 4abcd 注：与对照组比较，a P＜0.05；与浅表性胃炎组比较，b P＜0.05；与萎缩性胃炎组比较，c P＜0.05；与不典型增生组比较，d P＜0.05。

表 1 蛙皮素在各组中的表达水平

根据已知序列设计的引物，扩增结果经琼脂糖凝胶电泳显示，BN的扩增产物与预计一致，分别在169 bp处出现特异性的基因条带，在430 bp处也有内参照β-actin条带。BN与β-actin的mRNA的IDV比值见表 1。

图 2

注：M：marker；1：对照组；2：浅表性胃炎；3：萎缩性胃炎；4：不典型增生；5：胃癌。 图 2 各组蛙皮素mRNA表达

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。据统计世界范围内平均每年新发病例约为90万人，2010年查出的新发病已超过110万人，其发病率居恶性肿瘤的第4位^{[5, 6]}。在中国，胃癌的死亡率约为16/10万，在一些地区死亡率甚至可达60/10万^[7]。何艳等^[8]研究发现因早期手术治疗效果较好，胃癌平均死亡年龄与平均发病年龄相差较大。因而探讨胃癌发生发展规律，寻找新的胃癌早期筛查或诊断的标志物，实现早期发现、早期诊断、早期治疗的目的，对胃癌的防治及生存率的提高尤为重要。

胃癌的发生是多因素共同作用的结果，内分泌的变化起到不可忽视的作用。研究发现，BN是与胃癌发生发展密切相关的重要的胃肠激素之一。1994年，Rihardj B 首先报道，BN能促进人胃癌细胞株SIIA细胞的生长。2000年Uchida N^[9]研究显示，在体内BN/GRP拮抗剂能抑制裸鼠的人胃癌细胞移植瘤的生长。徐秀英等^[10]研究发现BN能促进BGC 823胃癌细胞的生长，且有剂量依赖性。研究表明，BN及其相似肽可促进肿瘤细胞的增殖，对胃癌的发生发展起着重要的促进作用。

本次研究结果显示，在胃黏膜癌变的过程中，胃黏膜组织中BN蛋白及mRNA表达水平呈现前期平稳，后期明显增高的变化趋势，其机制可能是生理状态下BN可在胃肠道内少量分泌。在浅表性胃炎、萎缩性胃炎等病理过程中，BN的分泌未受到影响。当胃黏膜上皮细胞发生不典型增生和发现癌变时，不仅细胞形态出现异常，而且细胞的功能和代谢也产生异常，结果导致BN分泌增多，并以自分泌方式促进癌变细胞增殖。值得注意的是，在胃癌前病变的关键时期，胃黏膜不典型增生者BN的水平已经明显增加，至胃癌时更明显递增，提示BN表达水平的变化对于胃癌发生发展进程的监测及胃癌的诊断具有重要意义。