中国公共卫生  2013, Vol. 29 Issue (9): 1289-1291   PDF    
引用本文
单颖, 刘军, 潘艳艳, 李莹, 曹雅明. 伯氏疟原虫感染不同年龄小鼠免疫反应特点[J]. 中国公共卫生, 2013, 29(9): 1289-1291.
SHAN Ying, LIU Jun, PAN Yan-yan, et al. Characterization of immune response to infection of Plasmodium berghei NK65 in mice of different age[J]. Chinese Journal of Public Health, 2013, 29(9): 1289-1291.
伯氏疟原虫感染不同年龄小鼠免疫反应特点
单颖1,2, 刘军2, 潘艳艳2, 李莹2, 曹雅明2     
1. 辽宁医学院免疫教研室, 辽宁 锦州 121001;
2. 中国医科大学免疫教研室
作者简介：单颖(1973- ),女,辽宁锦州人,副教授,博士,研究方向:感染免疫。
通讯联系人：曹雅明，E-mail:ya mingcao@yahoo.com.cn
摘要：目的 了解伯氏疟原虫(Plasmodium berghei NK65,P.b NK65)感染幼年和中年C57BL/6小鼠免疫反应特点。方法 P.b NK65感染3周龄幼年和8月龄中年C57BL/6小鼠,采用流式细胞分析技术检测不同年龄组小鼠脾细胞悬液中髓样树突状细胞(dendritic cells,DCs)数量,表面表达MHCⅡ类分子和CD86分子的DCs数量以及分泌IgG抗体的B细胞数量;ELISA方法检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平。结果 3周小鼠DCs数量[(40.08±3.54)×105]在感染后5 d明显升高,8月龄鼠在感染后5 d[(103.47±11.07)×105]及8 d[(104.04±1.92)×105]明显升高;3周鼠表面表达MHCⅡ类分子和CD86分子的DCs数量在感染后明显升高,8月龄鼠在感染后8 d表达MHCⅡ类分子[(239.40±16.32)×105]和CD86分子[(148.48±14.84)×105]数量明显高于3周鼠(P<0.05);3周鼠[(251.01±34.02) pg/mL]和8月龄鼠[(584.17±54.03) pg/mL] IFN-γ水平在感染后5 d均明显升高,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 3周和8月龄C57BL/6小鼠感染P.b NK65后,其细胞免疫和体液免疫存在明显差异。
关键词： 伯氏疟原虫     不同年龄     免疫反应    
Characterization of immune response to infection of Plasmodium berghei NK65 in mice of different age
SHAN Ying1,2, LIU Jun2, PAN Yan-yan2, et al    
Department of Immunology, Liaoning Medical College, Jinzhou, Liaoning Province 121001, China
Abstract: Objective To investigate the characteristics of immune response to infection of Plasmodium berghei NK65(P.b NK65)in young and middle aged C57BL/6 mice.Methods Three weeks and 8 months aged C57BL/6 mice were infected by P.b NK65 parasitized erythrocytes.Flow cytometry was applied to quantitatively analyze myeloid dendritic cells(DCs)and DCs expressing major histocompatibility complex classⅡ (MHCⅡ)or CD86.The levels of interferon gamma(IFN-γ)and interleukin-4(IL-4)in spleen cell supermatants were dynamically detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results The number of myeloid DCs(40.08×105)in young aged mice significantly increased 5 days after the infection.The number of myeloid DCs 5 and 8 days after the infection was 103.47×105 and 104.04×105 in the middle aged mice.The numbers of DCs expressing MHCⅡ or CD86 were 50.16×105 and 45.39×105 in young aged mice,and in middle aged mice the numbers were 239.40×105 and 148.48×105,which was markedly more than young aged mice.The level of IFN-γ significantly increased both in young aged(251.01 pg/ml)and middle aged mice(584.17 pg/ml).Conclusion The cellular and humoral immune responses to infection of P.b NK65 are different between the young and middle aged C57BL/6 mice.
Key words: Plasmodium berghei     different age     immune response    

根据WHO报告显示，中国近年疟疾发病率有所下降，但安徽、云南和海南3省及江淮流域仍应成为疟疾预防控制重点地区[1]，因此，卫生部提出到2020年要在中国范围内消除疟疾[2]。已有研究表明，儿童和成人对疟疾的免疫反应不同[3, 4]。儿童比成人对疟疾易感，随着年龄增长，对疟疾易感风险会逐渐下降[5, 6]。但目前对于成人体内所产生能够抵抗疟疾的不完全免疫而在儿童却缺乏的保护机制尚不清楚。因此，为进一步了解抗疟免疫不同年龄差异，本研究采用不同年龄C57BL/6小鼠感染伯氏疟原虫( Plasmodiom berghei;Nk65,P.b NK65)，通过检测细胞及体液免疫反应差异，探讨可以为幼年鼠提供抵抗感染的保护机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 疟原虫及实验动物感染

3周龄和8月龄雌性C57BL/6小鼠(中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号：SCXK6京2004-0001)经腹腔感染1×106 P.b NK65(日本 爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠)寄生的红细胞，感染不同时间的小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。 1.1.2 主要仪器及试剂

干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)ELISA试剂盒(R&D System,minneapolis,MN)、抗CD11c-FITC单抗,0.1 mg,(HL-3克隆)、抗CD11b-PE单抗,0.1 mg(M1/70克隆)、抗CD86-PE单抗,0.1 mg(3/23克隆)、抗MHCII -PE单抗,0.1 mg(M5/114.15.2克隆)、抗IgG-FITC,0.3 mL(eBioscience)、流式细胞仪(FACS Calibur),均购至美国BD Pharmingen公司。 1.2 方法 1.2.1 流式细胞术检测脾细胞中CD11c+CD11b+DCs(mDCs)数量及表面MHCⅡ类分子和CD86的表达水平

无菌取不同时间点小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，调整脾细胞终浓度为1×107/mL。取脾细胞悬液0.1 mL，加入抗CD11c-FITC单抗和抗CD11b-PE单抗或抗MHC-Ⅱ-PE单抗或抗CD86-PE单抗进行双色分析，另设阴性对照管。离心去上清后，用0.5 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)重悬细胞，流式细胞仪进行检测。 1.2.2 流式细胞术检测脾细胞中分泌IgG抗体的B细胞数量

脾细胞悬液0.1 mL加入流式细胞仪专用染色管中，每份样品用CD45R/B220-PerCP单抗和抗IgG-FITC抗体进行双色染色，另设阴性对照管和各单标管。避光孵育15 min，离心去上清后，用0.5 mL PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测。 1.2.3 脾细胞培养上清中细胞因子检测

于24孔培养板中培养脾细胞悬液48 h后，收集培养上清，用双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测IFN-γ和IL-4水平。酶标仪测定450 nm处的A值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro 4.3.1 LS软件分析，计算细胞因子含量。 1.3 统计分析

采用SPSS 11.0软件对数据进行处理，2组间比较采用独立样本t检验。 2 结 果 2.1 不同时间点虫体血症水平

感染后第3 d，3周和8月龄小鼠外周血中均出现疟原虫感染的红细胞，以后原虫血症水平呈相同的上升趋势，感染后20 d达到峰值而全部死亡，但不同时间点8月龄小鼠原虫血症水平均低于3周小鼠，特别是在感染后4~18 d两者原虫血症水平有明显差异(P<0.05)。 2.2 不同组别小鼠mDCs数量及表面表达MHCⅡ类分子和CD86表达水平(表 1)

结果显示，3周和8月龄小鼠mDCs数量、MHCⅡ、CD86水平均在感染后第5/8 d明显升高或达到峰值，3种指标峰值3周鼠均明显低于8月龄鼠(P<0.05)。

表 1 不同时间脾脏mDCs数量及MHCⅡ类分子和CD86表达水平(×105)
2.3 不同组织小鼠分泌IgG抗体B细胞数量(表 2)

结果显示，不同年龄组小鼠在感染后分泌IgG抗体的B细胞数量均呈现下降趋势，但3周鼠下降更为明显，同一时间点比较，3周鼠分泌IgG抗体的B细胞数量明显低于8月龄鼠(P<0.05)。

表 2 不同时间脾脏分泌IgG抗体B细胞数量(×105)
2.4 不同组别小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平表达(表 3)

2组在感染后第5 d，IFN-γ水平明显升高，但3周鼠IFN-γ水平明显低于8月龄鼠(P<0.05)。

表 3 不同组别不同时间IFN-γ和IL-4水平(pg/mL)
3 讨 论

CD4+Th1细胞免疫反应在疟疾感染早期，对控制原虫的增殖起关键作用。然而T细胞的激活和分化依赖于DCs，DCs在启动适应性免疫反应中起重要作用[7]。脾脏中DCs根据功能和形态分为不同的亚群，Th1反应主要是由mDC所调节，所以本研究比较了各感染鼠mDCs的数量和DCs成熟表面分子MHCⅡ、CD86的表达。结果显示，P.b NK65在3周及8月龄鼠均能诱导DCs的成熟和激活，使2组鼠均能在感染早期建立起Th1反应以控制原虫的增殖。但反应强度的不同使得8月龄鼠在感染早期原虫血症水平明显低于3周鼠。另外在细胞免疫中，IFN-γ的产生对于抗疟免疫Th1反应起关键作用，本研究中3周和8月龄鼠在疟原虫感染后尽管能建立起有效的Th1反应，但未能成功向Th2反应过渡而导致其全部死亡。

本研究结果提示3周和8月龄C57BL/6小鼠感染P.b NK65后，其细胞免疫和体液免疫存在明显差异，这种差异导致中年鼠的原虫血症水平明显低于幼年鼠，但这种差异并未显著到带来相反的感染结局。因此需要继续探讨其他疟原虫感染不同年龄小鼠后免疫反应特点，以建立鼠疟感染动物模型，用于研究与年龄相关的抗疟免疫反应。

参考文献
[1] 李亚楠,温亮,李承毅,等.中国2006-2010年疟疾流行趋势分析[J].中国公共卫生,2013,29(2):263-265.
[2] 丁俊.疟疾流行现状研究进展[J].中国公共卫生,2012,28(5):717-718.
[3] Vestergaard LS,Lusingu JP,Nielsen MA,et al.Differences in human antibody reactivity to Plasmodium falciparum variant surface antigens are dependent on age and malaria transmission intensity in Tanzania[J].Infect Immun,2008,76(6):2706-2714.
[4] Dent AE,Moormann AM,Yohn CT,et al.Broadly reactive antibodies specific for Plasmodium falciparum MSP-1(19)are associated with the protection of naturally exposed children against infection[J].Malar J,2012,11:287.
[5] Moormann AM.How might infant and paediatric immune responses influence malaria vaccine efficacy?[J].Parasite Immunology,2009,31:547-559.
[6] Nguyen HV,van den Eede P,van Overmeir C,et al.Marked age-dependent prevalence of symptomatic and patent infections and complexity of distribution of human Plasmodium species in central Vietnam[J].Am J Trop Med Hyg,2012,87(6):989-95.
[7] Banchereau J,Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity[J].Nature,1998,392(6673):245-252.