铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PAE)是一种常见的医院内获得性感染的重要条件致病菌^[1]。泛耐药铜绿假单胞菌(pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa，PDPAE),是指对头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类等5类以上抗菌药物全部耐药，但不包括多粘菌素及替加环素^[2]。随着广谱抗生素的广泛应用，住院时间的延长，免疫缺陷宿主的增加，抗生素的不合理使用，多重耐药甚至泛耐药铜绿假单胞菌明显增多，给临床抗感染治疗带来极大困难。为了解体外构建的泛耐药菌株与临床分离株在外排泵机制方面的差异，本研究通过次抑菌浓度诱导法^[3]建立泛耐药模型，并进一步检测及分析外排泵表型。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料

海南省人民医院细菌室在2010年1月—2011年6月间住院患者的各类标本中分离的泛耐药铜绿假单胞菌38株及临床分离的敏感铜绿假单胞菌12株。所有菌株均为不重复菌株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853，由海南省人民医院微生物室提供。 1.2 主要仪器与试剂

VITEK-2全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)，药敏纸片(英国Oxoid公司产品)。对泛耐药铜绿假单胞菌再采用K-B法进行确证，参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)判断标准^[4]。头孢他啶(葛兰素史克制药苏州有限公司)，哌拉西林/他唑巴坦(辉瑞制药苏州有限公司)，氨曲南(重庆莱美药业股份有限公司)，环丙沙星(德国拜耳医药保健有限公司)，亚胺培南/西司他丁(杭州默沙东制药有限公司)，丁胺卡那(河南辅仁怀庆堂制药有限公司)，外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(phenyl-arginine-β-naphthylamide,PAβN，美国sigma公司)。 1.3 方法 1.3.1 泛耐药模型构建

将12株临床分离的敏感铜绿假单胞菌在含1/2 MIC药物的营养肉汤中培养传代，每隔3 d转种1次，共3次，9 d后转MH琼脂固体培养基培养,采用K-B法验证药敏情况，根据NCCLS判断标准确认对当前药物耐药后，转入下一个药物，如未达当前药物耐药标准时，继续在含1/2最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)药物的营养肉汤中培养传代3 d，直至对当前药物耐药后转入下一个药物。诱导药物顺序依次为头孢他啶→哌拉西林/他唑巴坦→氨曲南→环丙沙星→亚胺培南/西司他丁→丁胺卡那。 1.3.2 4种外排泵(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM)表型检测

制备PAβN浓度为20 μg/mL的琼脂平皿和不含药物的琼脂平皿，将体外诱导株及临床分离株分别制备成10⁸ CFU/mL浓度菌液,用无菌棉签均匀涂布在平皿上，E-test法检测铜绿假单胞菌在不同培养基上对羧苄青霉素、红霉素、诺氟沙星和庆大霉素的MIC值。4种药物分别为MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM的特异底物，根据加与不加外排泵抑制剂MIC值降低3个稀释度及以上判断为相应的外排泵表型阳性^{[5, 6]}。 1.4 统计分析

单因素分析采用SPSS 13.0统计分析软件进行χ²检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 泛耐药模型的构建结果

12株临床分离的敏感铜绿假单胞菌经次抑菌浓度抗菌素逐步诱导，其中10株在3次诱导，9 d后转为泛耐药菌株，2株在亚胺培南/西司他丁组诱导3次，9 d后抑菌环直径较诱导前减小，但未达到耐药1次诱导后，成功转为耐药菌株。 2.2 4种外排泵表型检测

38株临床分离耐药株中外排泵表型阳性株依次为：MexAB-OprM阳性率为60.53%(23/38)，MexEF-OprN阳性率为28.95%(11/38)，MexCD-OprJ阳性率为23.68%(9/38)，MexXY-OprM阳性率为21.05%(8/38)，总外排泵阳性率为94.74%(36/38)。12株体外诱导耐药株中，MexAB-OprM 表型阳性率为66.67%(8/12)，MexXY-OprM表型阳性率为58.33%(7/12)，MexCD-OprJ表型阳性率为41.67%(5/12)，MexEF-OprN表型阳性率为8.33%(1/12)，总外排泵阳性率为91.67%(11/12)。2组菌株总外排泵阳性率均较高，差异无统计学意义(χ²=0.152,P=0.696)。12株临床敏感株外排泵阳性率25.0%(3/12)，均为MexAB-OprM，而诱导后耐药株总外排泵阳性率增加(91.67%，11/12)，差异有统计学意义(χ²=10.971,P=0.001)；主要表型MexAB-OprM阳性率(66.67%，8/12)对比差异亦有统计学意义(χ²=4.196,P=0.041)。 3 讨 论

铜绿假单胞菌外排泵抑制剂主要分为广谱抑制剂和特异性抑制剂。广谱抑制剂有PAβN、氰氯苯腙(CCCP)和利福平等，特异性抑制剂有吗啉类似物泵抑制剂等^[7]。PAβN本身缺乏抗菌活性，但是能够抑制细菌外排泵的表达，提高抗菌药物的疗效并且能够降低铜绿假单胞菌的侵袭性^[8]，研究表明，PAβN浓度为20 μg/mL时能显著提高PAβN对抗菌药物的敏感性^[9],其作用机制主要是与抗菌药物竞争泵内转运蛋白上的药物结合位点，使药物不受外排泵的影响，顺利到达作用位点发挥抗菌作用。本研究选用PAβN作为外排泵抑制剂，通过检测铜绿假单胞菌对4种外排泵作用底物的敏感性变化来筛选主动外排泵表型阳性菌。本研究通过次抑菌浓度诱导造成细菌对抗生素的长期暴露从而产生耐药，可成功构建泛耐药铜绿假单胞菌的体外耐药模型，提示临床用药时抗感染药物应足量使用，避免抗菌药物低浓度与细菌长期接触产生耐药而造成耐药菌产生，治疗失败。进一步的研究发现，临床分离泛耐药株与体外诱导耐药株中外排泵阳性率均较高，提示主动外排系统激活是铜绿假单胞菌耐药的主要常见机制，4种常见的外排泵表型均在2组菌株中检测出来，以MexAB-OprM最多见，与国内其他地区相比，结果基本类似但检出率有差异^[10]。另外，本研究尚发现临床敏感菌株经次抑菌浓度诱导耐药后外排泵表型阳性率明显增加，提示诱导耐药的机制主要为外排系统激活所致。这些结果也显示MexAB-OprM是铜绿假单胞菌最常见的外排泵表型，不同地区外排泵检出的构成及检出率的差异说明同一种细菌在不同地域由于菌株的异质性可能其耐药发生的分子机制稍有不同，导致临床上表现为耐药表型的不同。