艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的一种病死率极高的恶性传染病，目前在中国艾滋病病例数每年以10%~30%的速度增长^[1]，而在全球范围内尚无有效治愈艾滋病的方法。因此，做好艾滋病的预防工作是人类应对艾滋病挑战最有效最科学的对策^[2]。针对可能被HIV污染的血液、体液、分泌物、排泄物及其他物品，确定有效、快速的消毒剂及合理的消毒方法，可有效切断HIV传播，对预防艾滋病起重要作用。本研究选取几种常用消毒剂，在实验室中分别对存在于全血或血浆中的HIV进行消毒试验，采用核酸定量及病毒培养2种指标观察消毒效果。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验用病毒株和宿主细胞

病毒用HIV-1毒株LWJ(福建省疾控中心确认并分离)，该毒株可以在原代人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)和传代人T淋巴细胞系(human T lymphocyte lines,MT4)上复制并导致细胞病变(cytopathic effect,CPE)，为可持续传代、快/高复制、T细胞噬性的SI毒株。宿主细胞用MT4 细胞株作为HIV-1的测试细胞(厦门大学夏宁邵教授惠赠)，用含 10%胎牛血清的RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute)细胞培养基进行培养。 1.1.2 消毒剂

有效氯5.0%的含氯消毒剂(福州市康家卫生消毒制品厂)；二元包装过氧乙酸(福州市仓山榕岚消毒剂厂)，使用前应先按一定比例混合作用24~48 h；有效碘为0.3%碘伏(福建省建瓯市立医院劳服公司)；75%酒精(福州市晋安区金星卫生药械制品厂)；2%强化戊二醛(福州市晋安区金星卫生药械制品厂)。 1.1.3 其他

病毒核酸提取试剂盒(台湾Geneaid公司)，HIV-1核酸定量检测试剂盒(深圳凯杰公司)，HIV-1 P24抗原检测试剂盒(荷兰生物梅里埃公司)。 1.2 方法 1.2.1 病毒悬液的制备

从液氮中取出冻存 HIV-1 毒种LWJ，接种于含 10 mL MT4细胞悬液(含细胞 10⁵～10⁶个/mL)培养瓶中。逐日观察细胞病变，培养3～4 d时，收获病毒上清。收获时，将培养液取出，1 500 r/min离心10 min，并将含病毒的上清液按每管 0.5 mL 分装于无菌离心管(1.5 mL)中，冷冻保存于-80 ℃ 备用。 1.2.2 消毒液的配制

(1)含氯消毒剂：以去离子水配制成有效氯含量为5 000 、3 000、2 000、1 000、500 mg/L的溶液。(2)过氧乙酸：将A液和B液按10：8的比例混合，放置48 h后，测定含量，然后用去离子水配制成有效含量为5 000、3 000、2 000、1 000、500 mg/L的溶液。(3)碘伏：将原液为0.3%的碘伏消毒剂用去离子水配制成1 000、500、100 mg/L的溶液。(4)酒精：75%酒精溶液，原液进行试验。(5)戊二醛：将活化后的戊二醛以去离子水配制成0.5%、0.3%、0.1%溶液。 1.2.3 中和剂的选用

参考GB 15982-1995《医院消毒卫生标准》^[3]A6.2，选用相对应的等当量中和剂：含氯消毒剂、过氧乙酸及碘伏均选用含0.1%Na₂S₂O₃的含1%蛋白胨的生理盐水(tryptone physiology solution，TPS)；酒精选用含0.1%吐温80的TPS；戊二醛选用含0.3%甘氨酸的TPS。经按《消毒技术规范》(2002年版)^[4]2.1.1.10.5残留消毒剂化学中和法的鉴定试验，证实能够有效中和相对应消毒剂的消毒效果，并且对病毒及实验无不良影响。 1.2.4 消毒试验

(1)悬液定量杀灭试验操作程序：试验依据卫生部《消毒技术规范》(2002)版^[4]进行。在核酸定量试验中，为了更有代表性，我们采用含有HIV的全血或血浆与消毒剂混合；在病毒灭活试验中，为了提高实验敏感性及可操作性，我们采用病毒悬液替代全血或血浆与消毒剂混合。待消毒剂作用至各预定时间，分别吸取病毒与消毒剂混合液0.1 mL加于 0.9 mL 经灭菌的中和剂中，混匀。中和作用10 min。同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。(2)消毒效果测定和评价：核酸定量试验：按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ(Geneaid)的操作步骤提取上述悬液中的病毒核酸，用HIV-1核酸定量检测试剂盒(深圳凯杰公司)进行real-time RT-PCR，定量检测消毒前后HIV-1的核酸含量。病毒灭活试验：用细胞感染法测定消毒剂作用前后样本中HIV 的量。以P24抗原阳性作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值。细胞感染法具体操作按照《消毒技术规范》(2002年版)^[4]2.1.1.10.8进行。用无菌去离子水代替消毒剂进行平行试验，作为阳性对照；中和剂与消毒剂的中产物及中和剂对细胞毒性试验中，用中产物及中和剂代替消毒剂进行平行试验。培养第14 d时收集培养上清，进行P24抗原检测，结果判断参照HIV-1 P24抗原检测试剂盒。用终点稀释法计算病毒感染滴度，以半数细胞感染剂量(50％ tissue culture infective dose，TCID₅₀)表示，TCID₅₀对数值=病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例。(“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的最低组，以下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，以下简称“低于50%组”)。

。 1.2.5 评价标准

根据各种消毒剂的实际情况，将含氯消毒剂、过氧乙酸、碘伏、酒精的消毒试验分为血浆组及全血组，用核酸定量指标进行消毒效果的观察，而戊二醛仅用于对清洁的医疗器械消毒，因此只对存在于血浆中的HIV进行了戊二醛的灭活试验；同时用病毒悬液替代全血或血浆与消毒剂混合进行病毒灭活试验，用病毒的感染性TCID₅₀来评价消毒效果。依据卫生部《消毒技术规范》(2002)版2.1.1.10.8，消毒剂与病毒作用一定时间后，对病毒的灭活对数值≥4.00，可判定为达到消毒效果^[4]。 2 结 果 2.1 核酸定量法试验结果 2.1.1 含氯消毒剂试验结果(表 1)

有效氯3 000 mg/L含氯消毒剂对存在于血浆中的HIV作用5 min，灭活对数值>4.00，达到消毒效果，但对于存在于全血中的HIV的杀灭能力较差，有效氯含量为5 000 mg/L的浓度对病毒作用20 min，杀灭对数值为1.19，仍达不到消毒效果。

表 1

表 1 含氯消毒剂对HIV核酸灭活对数值 HIV存 在环境 作用时间 (min) 不同有效氯含量(mg/L)对HIV核酸灭活对数值 阳性对照 组对数值 5 000 3 000 2 000 1 000 500 血浆 5 >4.00 >4.00 1.54 1.20 1.26 5.60 10 >4.00 >4.00 2.03 1.29 1.27 15 >4.00 >4.00 1.47 1.26 1.26 20 >4.00 >4.00 1.14 1.51 1.52 全血 5 1.56 1.41 <1.00 <1.00 <1.00 5.60 10 1.54 <1.00 1.36 <1.00 <1.00 15 1.37 1.75 1.76 <1.00 <1.00 20 1.19 1.64 2.27 <1.00 <1.00

表 1 含氯消毒剂对HIV核酸灭活对数值

有效含量5 000 mg/L过氧乙酸对全血及血浆中的HIV作用20 min灭活对数值分别为2.00和1.41，均达不到消毒效果。

表 2

表 2 过氧乙酸对HIV核酸灭活对数值 HIV存 在环境 作用时间 (min) 不同有效氯含量(mg/L)对HIV核酸灭活对数值 阳性对照 组对数值 5 000 3 000 2 000 1 000 500 血浆 5 <1.00 1.61 <1.00 <1.00 <1.00 5.79 10 <1.00 2.20 <1.00 <1.00 <1.00 15 1.71 2.04 <1.00 <1.00 <1.00 20 2.00 2.13 <1.00 <1.00 <1.00 全血 5 1.08 <1.00 1.74 <1.00 1.38 5.67 10 1.20 <1.00 2.17 <1.00 1.41 15 1.49 1.28 1.79 <1.00 1.04 20 1.41 1.44 1.93 <1.00 <1.00

表 2 过氧乙酸对HIV核酸灭活对数值

有效碘含量为100 mg/L碘伏对存在于血浆中的HIV作用1 min，灭活对数值>4.00，达到消毒效果，但对于存在于全血中的HIV，需有效碘含量500 mg/L的浓度对病毒作用1 min，灭活对数值>4.00，达到消毒要求。

表 3

表 3 碘伏对HIV核酸灭活对数值 HIV存 在环境 作用时间 (min) 不同有效碘含量(mg/L)对HIV核酸灭活对数值 阳性对照 组对数值 1 000 500 100 血浆 1 >4.00 >4.00 >4.00 5.59 3 >4.00 >4.00 >4.00 5 >4.00 >4.00 >4.00 10 >4.00 >4.00 >4.00 全血 1 >4.00 >4.00 1.03 5.79 3 >4.00 >4.00 1.38 5 >4.00 >4.00 1.47 10 >4.00 >4.00 <1.00

表 3 碘伏对HIV核酸灭活对数值

75%酒精对全血及血浆中的HIV作用1 min，灭活对数值>4.00，达到消毒要求。0.1%戊二醛对存在于血浆中的HIV作用5 min，灭活对数值>4.00，达到消毒要求。 2.2 病毒灭活试验结果

含有效氯100 mg/L含氯消毒剂作用3 min、有效含量100 mg/L过氧乙酸作用3 min、有效碘含量50 mg/L碘伏作用1 min、75%的酒精作用30 s、0.05%戊二醛作用5 min，对HIV的灭活对数值均>4.00，均达到消毒效果。 3 讨 论

从以核酸定量为指标的消毒试验结果可以看出，对于存在于血浆中的HIV，含氯消毒剂、碘伏、75%酒精及戊二醛的灭活效果均较好，但过氧乙酸的消毒效果不理想。而对于存在于全血中的HIV，几种消毒剂的灭活效果均有所下降，多数消毒剂难于快速灭活病毒，这是由于全血中含有大量的有机物，这些有机物的存在，消耗了大量的消毒剂有效成分，尤其是有效氯及过氧化物，从而使参与灭活病毒的消毒剂有效浓度大大降低。有研究报道，酒精可以很快灭活存在于10%血清中的病毒，而当血清增加到100%时,灭活病毒所需的时间则延长很多^[5]，说明酒精渗入血清过程很缓慢。同样，游离氯对HIV灭活所需剂量的不同主要取决于有机物的含量和种类。当试验体系中的血清从10%上升到80%时，灭活HIV所需的有效氯含量则从100 mg/L上升到了500 mg/L，提示在进行消毒前去除所有有机物的重要性。因此在实际工作中，如有HIV污染，尽管HIV抗力较弱，但往往会伴有血液、体液等有机物质的存在，因此仍应加大消毒剂浓度与用量，如对污染环境的消毒处理；对于污染物品及不宜用高浓度消毒剂处理者可采取消毒、清洁、再消毒的方式，以确保消毒的安全及有效。碘伏的消毒效果理想，可能是由于碘伏除了游离碘对HIV有杀灭作用外，其中的表面活性剂对HIV也起到了协同作用。75%酒精对全血及血浆中的HIV灭活效果均很好，但是，在对酒精进行的中和剂鉴定试验中，发现中和产物对照组的核酸拷贝也有明显降低，并且，在有血液存在的情况下，酒精有凝固表面蛋白质的作用，这也可能是影响试验的原因之一。

在以P24抗原阳性作为判断指标，用细胞感染法所进行的病毒灭活试验中，大多消毒剂对HIV的消毒效果明显优于以核酸为指标的实验所得出的结果，消毒剂杀灭HIV所需的有效浓度很低，低于一般的细菌繁殖体。正如Hernández等^[6]报道的，HIV的复制很大程度上依赖于用来提供病毒生长的细胞的活力。而化学物质(包括消毒剂、中和剂及中和产物等)对细胞的毒性将会影响实验结果的正确性。如果用于培养的细胞被上述化学物质杀死，因此而产生的HIV复制的停止可以说是病毒灭活，但实际上是细胞毒性导致的结果。因此，本研究在试验中设置了对照组进行观察，结果表明，本研究所使用的消毒剂、中和剂及中和剂产物对细胞均无毒性。本结果中含氯消毒剂及酒精对HIV灭活所需的剂量和时间与以往的各项报道^{[5, 6]}基本一致。

众所周知，HIV属亲脂病毒，其对各种消毒剂的抗力低于细菌繁殖体，属于抗力最弱的微生物，最易被各种消毒剂杀灭。在本研究中，以核酸定量为指标进行的病毒灭活试验却得出了不同结果，部分消毒剂“灭活”HIV所需的浓度甚至超过了细菌芽胞。作为病毒灭活的一个间接指标，核酸定量方法虽然简单、便捷，但消毒剂使用浓度偏高，不能全面反映实际情况。虽然细胞培养所需时间长，试验条件要求高，操作复杂，但所检测的指标P24抗原是反映病毒是否具有传染性的一个直接指标^[5]，以该方法所进行的病毒灭活试验，所得的结果更能符合实际，更能反映消毒剂对HIV作用的真实情况，因此，以病毒灭活试验作为消毒剂对HIV灭活效果的最终指标较为直观。

中国正处于艾滋病流行快速增长期^[7]，艾滋病病人、HIV感染者不断增多，由此导致的HIV职业接触感染呈逐年上升趋势^{[7, 8]}。采取适合的消毒剂及合理的消毒方法，则可有效预防HIV传播。研究HIV对各种常用消毒剂的敏感性，则可对各种消毒剂的合理使用作出指导。本研究结果表明，HIV 对多种消毒剂均敏感，因此医务工作者对未明确定性的受检标本及患者排泄物，对生活中的可疑体液及其污染的桌面、台面、地面等，均应彻底消毒并清洁处理以防止HIV 意外传播。必须指出的是，在有机物存在情况下，应加大消毒剂用量与浓度，消毒效果才更有保证。