黄曲霉毒素(Aspergillus flavus toxin,AFT)主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的次生代谢产物，目前已分离鉴定出12 种，分别是黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂、P₁、Q₁、H₁、GM、B_2a和毒醇，黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂是粮油制品中黄曲霉毒素存在的主要形式^[1]。1993 年黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)划定为Ⅰ类致癌物，主要作用于肝脏，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁,AFB₁)最为多见，其毒性和致癌性也最强^[2]。1995 年世界卫生组织规定：食品中AFB₁ 最高允许浓度为15 μg/kg，婴儿食品中不得检出^[3]。中国对AFB₁ 的污染和控制也十分重视，在1982 年规定大米、食用油中AFB₁允许量标准为10 μg/kg，其他粮食、豆类及发酵食品为5 μg/kg^[4]。因此，AFT污染的有效检测对于保障食品安全具有重要意义。为此，本文对黄曲霉毒素的高灵敏检测技术研究进展综述如下。 1 黄曲霉毒素的危害

AFT主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米等农产品中，导致加工的食品和饲料中也存在AFT，食用了被AFT污染的食物后，会对机体造成损害甚至危及生命，其对人和动物的危害原因为：AFT对细胞的毒作用是干扰信息RNA和DNA合成，进而干扰细胞蛋白质合成，导致人和动物全身性伤害^[5]。AFB₁的毒性在黄曲霉毒素中是最强的，是氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍^[6]。曲霉毒素在体内的吸收、排泄均较快；如果不是持续性摄入，当摄入量相对较少的含有AFB₁食物时，大约经过10 d都会被各种排泄系统排出体外；若摄入量过大，会引起AFB₁急性中毒、肝损伤；中毒症状主要反应在肝细胞病变、肝坏死、肝癌的各种症状^[7]。 2 黄曲霉毒素的高灵敏检测方法

目前，食品中AFB₁限量已经成为限制出口的技术壁垒，为保障食用者的健康及出口贸易需要，提高AFB₁ 的检测能力、发展快速准确灵敏的检测技术势在必行^[4]。自20 世纪60 年代以来，建立的检测方法已经达30 余种，其中10 余种因为灵敏度不高已经较少使用，像简单生物学方法和化学方法。目前，高灵敏检测方法可分为5 大类：第1 类是半定量检测方法，如薄层色谱法(thin-layer chromatography,TLC)^[8]；第2 类是定量检测方法，包括建立在色谱基础上的理化方法，如液相色谱法^[9](liquid chromatography,LC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)等；第3类是建立在免疫化学基础上的快速测定的方法，如酶联免疫测定方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)^[10]和放射免疫测定(radio-immunoassay,RIA)^[11]；第4类是免疫化学和仪器分析结合的方法，免疫亲和柱-荧光分光光度法、亲和柱高效液相色谱法(immunoaffinity column liquid chromatography-high performance liquid chromatography,IAC-HPLC)^[12]等；第5类是建立在生物标记技术的时间分辨免疫荧光分析(time-resolved fluoreimmuoassay,TRFIA)^[13]。 2.1 薄层色谱法

TLC是测定黄曲霉毒素的主要方法，很多国家都把其做为国标中的主要测定方法；TLC是一种定性半定量的检测方法，其原理是：样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层板展开分离后，在365 nm 紫外荧光灯下，AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光；可根据其在薄层板上不同展开剂展开的距离为准，计算出显示的最低检出量来确定其含量；其所用试剂常见、设备简单、费用低廉、容易掌握，适用大量样品分离、筛选，一般的实验室均可开展，属于定性和半定量分析方法^[14]。

Stroka 等^[15]开发出的与光度检测器相结一体的TLC，对AFT最低检测限可以达到1 ng左右。Otta等^[16]在TLC基础上引入光度计，不仅能有效地提纯样品，还能一次同时检测多个样品。为了更好提高TLC的检测限，在TLC法基础上又发展了高效薄层层析法，可根据待测样品不同，改变各种分析条件，如展开剂、进样技术、展开槽、检测方式等，以得到最佳效果^[14]。TLC包括单向展开法和双向展开法，其中双向展开法检测样品时，也能进一步除去样品中的杂质提纯样品浓度，提高检测灵敏度，双向展开法省略了柱层析等粗提纯步骤，减化检测过程，提高了检测限^[17]。TLC由于对设备要求相对较为简单，一般实验室都能满足，利于普及，其仍是现在检测AFT的主要方法之一；其优势在于检测灵敏度高、操作简单，利于推广普及；缺点是检测样品的时候，需要直接接触标品，对试验人员有潜在的健康危险，接触剂量比较大或小剂量持续接触会造成中毒或肝癌的发生，所以在实验检测过程中，要注意安全措施的保护^[8]。 2.2 液相色谱法

LC是20世纪发展起来的1 种最新的检测技术，在过去的一个世纪里，LC在各种化学物检测过程中，发挥了重大作用；其原理是根据样品中各种成份在仪器内部固定相和流动相中的分配系数、吸附能力等亲和能力不同，而达到分离的目的；其最大优点是，不用直接接触样品，就可以分离检测出样品中待检成分的含量，而且准确率高，灵敏度高、检测限低、操作方便；根据流动相不同，可分为气相色谱、固相色谱等，而随着检测要求的提高，后来又发展到HPLC ^[18]。

HPLC是利用荧光检测器，将样品通过提取、净化、衍生、测定，具有高分辨率、快速、准确性好、灵敏度高、检测限低等优点，近年越来越多地用于黄曲霉毒素测定，尤其AFB₁的检测^[9]。特别是反相高效液相色谱法可成功分离、测定出食品中4 种AFT，达到符合规定标准的检测目的^[19]。正相高效液相色谱法(normal phase liquid chromatography-high performance liquid chromatography,NP-HPLC)一般使用硅胶柱，流动相含有三氯甲烷或二氯甲烷，但是三氯甲烷或二氯甲烷的存在会引起AFB₁和AFB₂的荧光猝灭现象发生，造成检测结果失真；Thean等^[20]通过改变流动相成份等措施，采用在不同波段下测黄曲霉毒素的荧光方法，成功解决了这个难题。Sobolev ^[21]通过新研发了Al₂O₃作为新流动相，成功解决了荧光猝灭现象的发生，提高了检测灵敏度。

由于检测食品中AFT时，需要对样品进行提纯、分离，而HPLC对黄曲霉毒素的分离方法主要有2类：免疫亲和柱和多功能净化柱；免疫亲和柱是根据单克隆抗体性质与载体蛋白偶联后，成功将其填充于柱内形成，并利用抗原抗体特异性反应，根据其填充物能与黄曲霉毒素抗原产生一一对应的特异性吸附关系制作而成；多功能净化柱以极性、非极性及离子交换等几类基团组成填充剂，可选择性地吸附样液中的脂类、蛋白质等杂质，当黄曲霉毒素通过柱子时不被吸附而直接通过^[22]。冯靓等^[23]使用高效液相色谱仪及荧光检测器分析食物中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量，在检测的所有的样品中，花生酱中的黄曲霉毒素为2.41 μg/kg；大米中的黄曲霉毒素为0.15 μg/kg；干花生中的黄曲霉毒素平均含量为0.04 μg/kg。提示高效液相色谱法测定样品中黄曲霉毒素时，其重现性较好，定量准确，操作精细，敏感性好，而且一次可以测定出黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂含量。 2.3 免疫化学法 2.3.1 酶联免疫吸附测定

ELISA是结合免疫、酶和生化技术检测黄曲霉毒素的一种新方法^[24]。ELISA是20世纪70年代出现的新的免疫技术，其主要原理是根据抗原(或抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与样品中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用特定的仪器测定出酶活力的方法来增加测定的敏感度^[25]。计融等^[10]在生产抗总黄曲霉毒素单克隆抗体基础上，利用间接竞争ELISA研制出具有中国自主知识产权的总黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒，其最低检出浓度为0.26 μg/kg，对样品的最低检出量为1.5 μg/kg。但ELISA是一种定性或半定量的方法，选择不同的单克隆抗体，会造成结果存在一定误差，所以其定量相对不太准确，但具有快速、低成本和适于大批量检测的优势，适合推广^[26]。 2.3.2 放射免疫法

PIA与ELISA原理相同，唯标记物不同，前者标记物为放射性元素，后者标记物为酶；一般采用的放射性标记元素为氚(³H)，方法是将毒素-³H标记物与样品加抗体进行竞争性结合，除去未结合的部分，测定其放射性，放射性强则说明样品中毒素含量低，反之毒素含量高^[27]。闫磊等^[11]用RIA检测牛奶样品中黄曲霉毒素，检出限为0.25 μg/kg。该检测方法可靠，灵敏度高，特异性强，与其他检测方法(液相法、薄层法、酶联免疫法)比较优点明显：前处理简单、测定周期短、速度快；但是，RIA有放射性元素污染问题，故近几年来应用此法的报道较少^[27]。 2.4 亲和柱高效液相色谱法

IAC-HPLC可以避免传统TLC和HPLC的缺点，利用免疫亲和柱与TLC和HPLC结合，不仅可以大大提高黄曲霉毒素检测的工作效率，还能提高检测结果的灵敏度和准确性，使检测结果达到定量准确、快速简便的要求^[28]。李佐卿等^[29]用IAC-HPLC快速检测牛奶和奶粉样中的黄曲霉毒素含量，AFT总量最低检出浓度为1 μg/kg，其线性效果好，样品回收率为90%。姜兆兴等^[12]通过类似的方法检测饲料中黄曲霉毒素含量时，样品中黄曲霉毒素检测下限为0.5 μg/kg，线性范围为2~50 μg/kg，线性结果好，而样品的平均回收率也达到了国家标准要求。提示该方法具有灵敏度高、精密度好、检测限低等优点；其把黄曲霉毒素相应的检测物固定在柱内，在检测样品时，可以不接触标准品可直接测出结果，从而避免潜在的中毒危害^[30]。 2.5 时间分辨免疫荧光分析

随着生物标记技术不断进步，免疫分析技术得到了长足发展；免疫分析技术逐步由放射免疫分析技术向非放射免疫技术转变；在此期间，涌现了一大批非放射免疫技术，例如酶免分析技术、化学发光免疫分析技术、TRFIA等^[31]。TRFIA是20 世纪80 年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术；采用其进行AFB₁检测的灵敏度和量程较ELISA成倍增加，其灵敏度可达0.01 μg/L，测量范围可达0.01~100 μg/L，既可以满足食品中AFB₁低浓度的限量要求，也可以满足饲料中AFB₁较宽范围的限量要求，是一种简便、快速、经济的可进行大批量样品筛查的方法^[13]。 2.5.1 TRFIA的技术原理

用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，与其螯合剂、增强液(有一部分不需要)在待反应体系(如：抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的^[32]。 2.5.2 TRFIA的优势

荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差，称为Stokes位移；普通荧光物质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重；游离铕的荧光信号虽然相当微弱，但当Eu³⁺与螯合剂形成螯合物时，产生分子内和分子间能量传递，使Eu³⁺的荧光强度明显增强，Stokes位移达200 nm，容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰^[33]。镧系元素与普通的荧光团比较，其离子螯合物荧光的衰变时间长，为传统荧光的103~106 倍；其荧光不仅强度高，而且半衰期也很长，介于10~1 000 μs之间；用时间分辨荧光仪测量Eu³⁺螯合物的荧光时,在脉冲光源激发之后，可以适当延迟一段时间，待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量，这时就只有Eu³⁺标记物的特异性荧光，即通过时间分辨，极大地降低了本底荧光，实现了高信噪比，是TRFIA高灵敏度和低干扰的原因之一，如果在使用链霉亲合素-生物素系统，可更好地降低非特异性荧光干扰^[34]。

镧系螯合物激发光光谱较宽，最大激发波长为300~500 nm，可通过增加激发光能量来提高灵敏度，而其发射光谱带较窄，甚至不到10 nm，可采用只允许发射荧光通过的滤光片，进一步降低本底荧光^[32]。Eu³⁺等镧系标记物与放射性同位素比较不受半衰期的影响，如¹²⁵I标记试剂最长可用3 个月，酶标记物常因其纯度、显色底物不稳定等问题,使其应用受到限制；Eu³⁺与双功能螯合剂螯合，可形成稳定的螯合物，稳定性很高，保质期达到2 年；Eu³⁺标记物体积很小(为原子标记)，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，既保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小)，又可实现多位点标记；标记物稳定就可以对标记物进行多次激发，通过对每次激发的荧光信号累加后取平均值，可大大减少偶然误差，提高准确度；同时多位点标记技术，不仅使检测更灵敏，也使一个试剂盒能够同时检测出≥2 种项目^[35]。 2.5.3 在黄曲霉毒素检测方面的应用

黄飚等^[13]采用时间分辨荧光技术建立了高灵敏的AFB₁间接竞争免疫分析法(AFB₁-TRFIA)，其灵敏度为0.01 μg/L，测量范围为0.01~100 μg/L，批内和批间变异分别为4.1%和6.8%，平均回收率为97.2%；采用TRFIA技术进行AFB₁检测的灵敏度和量程较ELISA成倍增加，其灵敏度高，测量范围较宽，既可以满足食品中AFB₁低浓度的限量要求，也可以满足饲料中AFB₁较宽范围的限量要求，是一种简便、快速、经济的可进行大批量样品筛查的方法。黄飚等^[35]还采用时间分辨荧光免疫分析技术建立赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)和AFB₁的高灵敏TRFIA检测方法，并研制出具有中国自主知识产权的快速、灵敏的OTA-TRFIA、AFB₁-TRFIA检测试剂盒，检测AFB₁的灵敏度为0.02 μg/L，测量范围为0.02~100 μg/L，检测OTA的灵敏度为0.05 μg/L，测量范围为0.05~50 μg/L，其灵敏度高，可测范围宽，稳定性好，一次操作可以同时得到AFB₁、OTA结果，是一种简便、快速、经济的可进行大批量样品筛查的方法。 3 展 望

综上所述，HPLC和IAC-HPLC法虽灵敏度，但所需设备昂贵，对操作人员要求较高，不适合在基层广泛应用^[9]；ELISA灵敏，且一次可测多个样品，成本低，但准确度差，只适合于对大量样品进行初筛^[26]；国际和国内黄曲霉毒素限制正在逐步加强，限量标准也在不断降低，所以更需要找到一种灵敏度和特异性高，简便快速容易普及应用的方法来检测黄曲霉毒素。TRFIA集酶标记、同位素标记技术的优点于一身：灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂寿命长，操作简便和非放射性等特点，非常适用于黄曲霉素的超微量分析，是一项很有前途的、值得推广的技术，已经成为食品安全检测方面的重要手段^[31]。