有研究表明，芒果叶含芒果苷、异芒果苷、槲皮素等多种化学成分^[1]。芒果富含黄酮类物质，对人具有明显的清除自由基和抗氧化作用^[2]。药理研究结果表明，芒果叶中黄酮具有抗真菌、抗癌作用^{[3, 4]}。芒果叶作为药材资源非常丰富，且具有价格低廉、四季可采等优点，具有研究和开发的潜力，但其在总黄酮方面研究较少。本研究应用超声技术辅助提取芒果叶中的总黄酮，采用清除自由基及抗脂质过氧化指标研究其抗氧化作用，为充分开发和利用芒果叶资源，为天然抗氧化剂开发以及临床应用提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 实验原料

新鲜芒果叶(广州大学城)。 1.2 主要仪器与试剂

DFT-50 型50 g高速中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)；KQ-500 E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-2000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SH2-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器责任有限公司)；101-A数显电热鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)；Spectrum Lab 22 pc可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；TGL-10B高速低温离心机(上海安亭科学仪器厂)。芦丁标准品(美国 Pharmacopeia公司)；抗坏血酸标准品(天津市科密欧化学试剂开发中心)；硝酸铝、焦性没食子酸、10-菲罗啉、硫代巴比妥酸(上海试剂二厂)；三(羟甲基)氨基甲烷(广州国药集团化学试剂有限公司)。 1.3 方法 1.3.1 芒果叶前处理

芒果叶清洗干净,放入鼓风电热恒温干燥箱90 ℃干燥至恒重，然后用粉碎机粉碎，乙醚回流除去脂质及色素，得到芒果叶干粉备用。 1.3.2 芒果叶总黄酮提取^[4]

称量芒果叶粉末10.00 g，加入100 mL95%乙醇，在70 ℃超声波(超声工作频率40 kHz)提取40 min，抽滤。滤渣按上述方法处理,合并2 次滤液，使用旋转蒸发器减压回收，干燥，备用。 1.3.3 芒果叶提取物中总黄酮含量测定^{[5, 6]}

采用亚硝酸铝比色法测定。芦丁为标准，参照文献^{[5, 6]}方法制作标准曲线。准确称取芒果叶提取物0.05g，用80 %乙醇溶解并定容到100 mL，浓度50 mg/mL作为样品。精确吸取1.00 mL，采用亚硝酸铝比色法，以试剂空白为参比，在510 nm处测吸光度(A)值，计算芒果叶提取物中总黄酮含量。 1.3.4 芒果叶总黄酮对羟自由基清除能力测定

取上述样品溶液1.0 mL(浓度50 mg/mL)，参照文献^[7]的方法建立反应体系模型,测定羟自由基的清除能力并计算清除率。维生素C溶液0.1 mL(浓度1 mg/mL)作对照。 1.3.5 对超氧阴离子自由基的清除能力测定^{[8, 9]}

取上述样品溶液1.0 mL，采用邻苯三酚自氧化法测定样品对超氧阴离子自由基的清除能力。维生素C溶液0.1 mL(浓度1 mg/mL)作对照。 1.3.6 芒果叶总黄酮对小鼠红细胞氧化溶血作用测定^{[10, 11]}

以小鼠眼眶取血，加入乙二胺四乙酸抗凝后，以3 000 r/min离心10 min，分离得到红细胞，冷生理盐水洗涤红细胞3 次，再以生理盐水制备成0.5%小鼠红细胞悬浮液，备用。加入不同浓度样品0.2 mL(0.05、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/mL) 观察其对 H₂O₂诱导小鼠红细胞自氧化溶血的作用，以生理盐水调零，于520 nm处比色测定吸光度(A)值；对照组以等体积生理盐水代替样品溶液和H₂O₂，其余同样品组。根据吸光度(A)值计算溶血率和抑制率。 1.3.7 芒果叶总黄酮对小鼠肝匀浆脂质过氧化影响测定^{[12, 13, 14]}

肝匀浆在温育条件下可以发生自氧化反应产生自由基，生成丙二醛(malondialdehyde，MDA)。通过比较正常组中芒果叶总黄酮各浓度对肝匀浆MDA生成的影响，与对照组中芒果叶总黄酮对H₂O₂诱导肝匀浆脂质过氧化的影响进行比较，计算其抑制率。小鼠禁食12 h后，脱颈致死，迅速取新鲜的小鼠肝组织以冰冷的生理盐水洗净血渍，用滤纸吸干水分后称重，按照1∶9取相应体积的生理盐水，用玻璃组织匀浆器于冰浴中制成匀浆液，以3 500 r/min离心20 min，取上清液放40 ℃冰箱保存待用。取1%小鼠肝匀浆1 mL，加不同浓度的样品溶液0.5 mL(0.05、0.50、1.0、5.0、10.0 mg/mL)；对照组加入0.5 mL的无水乙醇，参照文献^{[12, 13, 14]}进行小鼠肝匀浆自氧化实验和H₂O₂诱导肝匀浆脂质过氧化的实验。每组实验均设3 个平行管,实验重复3次。 1.4 统计分析

采用Excel 2003软件对数据整理分析。 2 结 果 2.1 芒果叶提取物中总黄酮含量测定

以芦丁标准液浓度x为横坐标，吸光度值y为纵坐标作 y关于x的一次函数，回归方程为y=10.9 x + 0.004，R²= 0.999 7，在 0～0.04 mg/mL范围内呈良好的线性关系。根据标准曲线的回归方程计算，芒果叶提取物中总黄酮含量为38.35%。 2.2 芒果叶总黄酮抗氧化作用测定 2.2.1 对羟自由基的清除能力

维生素C和芒果叶总黄酮在实验的浓度范围内对羟自由基均有清除作用，且浓度与清除率呈现良好的量效关系，随着浓度增加，清除率增大。由清除率和浓度拟合方程，维生素C和芒果叶总黄酮对羟自由基的半数清除浓度(50% inhibitory concentration，IC₅₀)分别为0.546 9、2.973 9 mg/mL，表明芒果叶总黄酮对羟自由基有一定的清除作用，其清除能力弱于维生素C。 2.2.2 对超氧阴离子自由基的清除能力

维生素C和芒果叶总黄酮对超氧阴离子自由基清除的IC₅₀分别为0.253 0、3.861 2 mg/mL，表明芒果叶总黄酮对超氧阴离子自由基有一定的清除作用，其清除能力弱于维生素C。 2.2.3 各组H₂O₂诱导小鼠红细胞氧化溶血情况(表 1)

在0.05～10.0 mg/mL范围内，随芒果叶总黄酮浓度增加，对小鼠红细胞H₂O₂诱导的氧化溶血的抑制率逐渐增加，表明芒果叶总黄酮可以抑制红细胞的氧化损伤，保护红细胞膜，且呈良好的剂量效应关系，可能与芒果叶总黄酮对羟自由基的清除有关。

表 1

表 1 各组H2O2诱导小鼠红细胞氧化溶血情况(n=3) 组别 浓度 (mg/mL) H2O2诱导溶血 A520 nm 溶血率(%) 抑制率(%) 空白对照组 0.0 0.232±0.003 H2O2对照组 0.0 0.472±0.005 芒果叶总黄酮 0.05 0.421±0.003 89.19 10.81 0.5 0.374±0.004a 79.23 20.77 1.0 0.323±0.006b 68.43 31.57 5.0 0.287±0.005b 60.81 39.19 10.0 0.238±0.003b 50.42 49.58 注：与0.05 mg/mL芒果叶总黄酮组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 1 各组H2O2诱导小鼠红细胞氧化溶血情况(n=3)

芒果叶总黄酮浓度(x)与抑制率(y)之间拟合曲线，得出回归方程为：y = 5.263 9 ln(x) + 50.947，R² = 0.982 1，表明芒果叶总黄酮在1～10 mg／mL剂量范围内能有效抑制肝组织自发性脂质过氧化。在加入H₂O₂之后，小鼠肝匀浆中产生的MDA明显增加，不同剂量芒果叶总黄酮组MDA生成量与空白对照组比较明显降低，表明芒果叶总黄酮可以抑制·OH所致的小鼠肝线粒体脂质过氧化，且抑制率随浓度增大而提高。

表 2

表 2 各组小鼠肝匀浆脂质过氧化情况比较(n=3) 组别 浓度 肝匀浆自动脂质过氧化 H2O2诱导肝匀浆脂质过氧化 AA532nm 抑制率(%) AA532nm 抑制率(%) 空白对照组 0.00 0.152±0.005 0.00 0.894±0.009 0.00 芒果叶总黄酮 0.05 0.098±0.006 36.13 0.891±0.003 30.54 0.5 0.084±0.005 44.65 0.859±0.005 45.71 1.0 0.073±0.008a 51.74 0.816±0.004a 62.65 5.0 0.066±0.007b 59.88 0.786±0.007b 66.51 10.0 0.057±0.004b 63.23 0.765±0.005b 69.12 注：与0.05 mg/mL芒果叶总黄酮组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 2 各组小鼠肝匀浆脂质过氧化情况比较(n=3)

活性氧所引起的氧化损伤与多种疾病发生密切相关，黄酮类物质具有较强的抗氧化作用^{[15, 16]}。本研究结果表明，芒果叶总黄酮对·OH及O^2-自由基具有一定的清除能力，对·OH清除能力强于对O^2-清除能力,但低于维生素C和芦丁的清除能力。本研究结果还表明，芒果叶总黄酮对肝组织匀浆自发性及H₂O₂诱导的MDA生成均有明显抑制作用，并且存在明显的量效关系。芒果叶总黄酮对自由基的清除作用可能原因为：芒果叶总黄酮能减少H₂O₂诱导的红细胞溶血的发生，抑制红细胞的氧化损伤，保护红细胞膜，且呈良好的剂量效应关系。本研究结果提示，芒果叶总黄酮具有一定的抗组织脂质氧化能力，且资源丰富、成本低廉，具有潜在的开发利用价值。