中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (12): 1666-1668   PDF    
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张昕, 汪琦, 张惠媛, 陈广全, 张捷. 水产品中副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(12): 1666-1668.
ZHANG Xin, WANG Qi, ZHANG Hui-yuan, et al. Subspecies typing of Vibrio parahaemolyticus in aquatic products with pulsed-field gel electrophoresis[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(12): 1666-1668.
水产品中副溶血性弧菌脉冲场凝胶电泳分型
张昕, 汪琦, 张惠媛 , 陈广全, 张捷    
北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室, 100026
收稿日期: 2011-07-14.
基金项目: 国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2008IK139)
作者简介: 张昕(1974- ),女,辽宁人,高级工程师,硕士,主要从事食品微生物学检测及相关研究。
通讯作者: 张惠媛,E-mail:zhanghy@bjciq.gov.cn
摘要: 目的 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对水产品中副溶血性弧菌进行分子分型。方法 采用PFGE技术,对80株分离自11个国家和中国浙江省和山东省的水产品中的副溶血性弧菌进行分子分型;基因组DNA用Not I和Sfi I 2种酶进行消化。结果 Not I和Sfi I 2种内切酶均得到68种带型,综合系统树图中分成70种带型;Not I和Sfi I的分辨率分别为78.8%和76.3%;14株来自加拿大的菌株分聚成相似度100%的4组,其中有4株菌和10株菌分别聚成相似度91.8%和93.3%的2组;挪威和新西兰分别有3株和2株菌相似度为100%;其他国家的菌株无与本国相同的菌株。结论 2种酶均适合于副溶血性弧菌的PFGE分型,Not I的效果略好于Sfi I;菌株间的亲缘关系与来源地无明显关联,但具有毒性基因的菌株更易在系统发育树上处于较近的分枝上。
关键词: 副溶血性弧菌     脉冲场凝胶电泳(PFGE)     分子分型    
Subspecies typing of Vibrio parahaemolyticus in aquatic products with pulsed-field gel electrophoresis
ZHANG Xin, WANG Qi, ZHANG Hui-yuan , et al    
Laboratory for Food, Technique Center, Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China
Abstract: Objective To assess subspecies typing of Vibrio parahaemolyticus strains from aquatic products with pulsed-field gel electrophoresis(PEGE).Methods A total of 80 selected isolates obtained from aquatic products were characterized with PFGE method.Genomic DNA w as digested with restriction endonucleases NotI and SfiI.Results The isolates were grouped into 68 PFGE patterns by NotI and SfiI.Moreover,there were 70 PFGE patterns after compared with the results of the two restriction enzymes.The discrimination power of NotI was 78.8% and that of SfiI was 76.3%.Fourteen strains were from Canada four strain groups according to the Dice coefficient of 100%,thereinto,the Dice coefficient of four strains was 91.8% and the Dice coefficient of ten strains was 93.3%.Three strains form Norway and two strains from New Zealand belonged to 2 groups,with the Dice coefficient of 100%.There were no other same strains detected.Conclusion The results indicate that PFGE with both NotI and SfiI could be used in discriminant analysis for Vibrio parahaemolyticus,but NotI is more effective.The clustering analysis showes a clear disagreement among the strains and their sources.Furthermore,the strains with virulence genes are included in the same or contiguous clusters.
Key words: Vibrio parahaemolyticus     pulsed-field gel electrophoresis     molecular typing    

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是1种嗜盐的革兰氏阴性细菌,常可以从海滨、河口环境或在其中生活的鱼虾贝类体内分离到,能引起人类严重的肠胃炎;如果水产品未得到适当加工,很可能成为副溶血性弧菌的传染源[1, 2]。应用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术能在该菌污染发生后快速找到污染菌株的源头[3]。本研究对从11个国家和中国浙江省和山东省的水产品中分离到的80株副溶血性弧菌进行PFGE分型,探讨不同来源的副溶血性弧菌之间的遗传相关性和亲缘关系。

1 材料和方法 1.1 菌株及其来源(表 1)

80株副溶血性弧菌为2004-2009年北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心食品实验室从多种水产品中分离所得。国外水产品来自北京口岸进口产品,国内水产品为北京口岸出口产品,均按照无菌要求进行采样。所用分离鉴定方法在2008年11月1日前参照文献[4],之后参照文献[5]方法进行。所有菌株均经过API 20E或VITEK 2 Compact生化鉴定后确认。PFGE相对分子量标准为布伦登卢普沙门氏菌(Salmonella ser.Braenderup) H9812菌株(中国疾病预防控制中心营养与食品安全所)。

表 1 菌株来源地及菌株数
1.2 主要仪器与试剂

VITEK 2 Compact微生物全自动鉴定系统、BioMérieux Vitek浊度计(法国BioMérieux公司);恒温振荡水浴(德国Memmert公司);纯水仪(美国MILLIPORE公司);CHEF-MAPPERTM XA脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司);凝胶成像系统(法国VILBER LOURMAT公司)。API 20E (法国BioMérieux公司);三甲醇氨基甲烷[tris (hydroxymethyl) aminoethane,Tris]、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、5倍Tris-硼酸EDTA缓冲液(5 × TBE)[生工生物工程(上海)有限公司];SeaKem Gold琼脂糖(美国Cambrex Bio Science Rockland公司);蛋白酶K (德国Merck公司);N-十二烷基肌氨酸钠和溴化乙锭(ethidium bromide,EB)(美国Sigma公司);限制性内切酶Not I、Xba I (美国NEB公司)和Sfi I (瑞士Roche公司);Tris-盐酸(美国Promega公司)。

1.3 脉冲场电泳

DNA提取、消化和PFGE电泳参照文献[6]方法进行。所用菌悬液的浓度为3.6~4.5麦氏单位(Mcfarland standard),电泳时间为20 h。

1.4 结果分析

电泳图谱以Xba I酶切的H9812作为统一的分子量标准进行校准,确定条带位置,必要时进行手工校正。获得的脉冲场电泳图谱参照软件说明书用BioNumerics数据库软件(比利时Applied Maths BVBA公司)进行识别处理,生成的系统树图,不同菌株之间的电泳条带的相似系数用Dice系数表示,范围在0~100,0表示完全不相关,100表示完全相同,出现不同条带即判定为不同型别。

2 结果 2.1 2种内切酶效果比较

2种酶酶切后的系统树图均产生了68种带型。Not I酶切后,有5组菌株具有100%相似度,每组分别有3、2、2、5、5株菌。Sfi I酶切后,有7组菌株具有100%相似度,每组分别有2、2、2、4、5、2、2株菌。将Not I和Sfi I酶切系统树图综合分析后形成2种酶的综合系统树图,有70种PFGE条带模式,共有5组相似度100%的菌株,分别有2、2、2、4、5株菌。有2株菌在Sfi I酶切后,由与其他菌株有100%同源性(Not I酶切)降为97%和87%相似度。另有4株菌在Sfi I酶切后分为相似度100%的2组,但在Not I酶切后,相似度分别为94.1%和96.6%。Not I的分辨能力略强于Sfi I,前者能将78.8%(63/80)的菌株区分开,后者能将76.3%(61/80)的菌株区分开。

2.2 菌株间的亲缘关系

来自加拿大的菌株最多,有32株,亲缘性表现得比较明显,有14株菌分聚成相似度100%的4组,每组分别有2、2、5、5株菌;其中有4株菌和10株菌分别聚成两大分支,其相似度分别为91.8%和93.3%。来自挪威的3株菌相似度为100%,新西兰的2株菌相似度为100%。其次来源较多的依次是法国(10株)、美国(9株)和日本(9株),但都无与本国相同的菌株,而与其他国家的菌株在亲缘关系上相互交叉。

3 讨论

本研究发现,相同的菌株用2种酶消化后,其在系统树图的位置出现较大差异。只有用相同的酶切和电泳体系才能使多株菌的图谱具有可比性,所以选择合适的内切酶较为重要。有研究证明,Not I和Sfi I是最适合弧菌PFGE分型的限制性酶[3, 7, 8, 9, 10],与本研究结论一致。Wang等[3]通过对多种限制性酶的比较,发现Not I在经济上更实惠,而且能产生更清晰的图谱,故建议在副溶血性弧菌的分子分型和全球监控中使用的标准PFGE程序,将Not I做为第一限制性酶,Sfi I做为第二限制性酶。

本研究还表明,来自不同国家或地区的菌株,其PFGE带型具有高度的多样性,而某一种PFGE带型并不能特别对应于某个来源地或某种海产品,即从不同国家产品中分离出来的菌株也能出现完全相同的PFGE带型,与Wong等[11]的研究结论相同。陈广全等[12]对包含本研究80株菌在内的267株副溶血性弧菌进行毒性基因检测,发现有14株菌同时含有副溶血性弧菌的致病基因tdh和trh基因,包括了本研究中的12株菌。这12株菌分别聚成相似度100%的3组,其中有2组菌经2种酶切后综合相似度为93.3%。具有毒性的菌株在PFGE分型中表现出高度亲缘性。这一结论对于流行病学中致病菌污染源头的调查具有积极意义。近年来,中国进口海产品的数量一直在增加,应做好细菌菌株PFGE分型,快速地确定分离株之间的亲缘关系,以便采取有效的传染控制手段,防止海产品携带的副溶血性弧菌在中国传播,甚至引发食源性中毒事件。

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