布鲁氏菌病( brucellosis，简称布病) 是由布鲁氏菌属( Brucella) 细菌侵入机体引起的人兽共患的传染－ 变态反应性疾病。近些年，辽宁省布病疫情呈明显的上升趋势，居中国前列，对人民生命财产安全造成了巨大的威胁^[1]。多位点可变数目串联重复序列( multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis，MLVA) ^[1]即多位点可变数量串联重复序列分析，是近年发展起来的以PCR 为基础，根据被检菌株散在于基因组中不同位点的、变数量串联重复序列( variable number tandem repeat，VNTR) 的重复单元拷贝数的差异来进行分子分型的技术。为分析辽宁省2010 年布病的流行特征及菌型基因特征情况，采用MLVA 分型方法，选择Le Fleche 等^[2]提出的布鲁氏菌MLVA-16 分型引物对辽宁省2010 年分离到的33 株羊种布鲁氏菌进行基因分型研究。

2010 年辽宁省布病疫情资料来源于疾病监测信息报告管理系统。辽宁省疾病预防控制中心感传所细菌病实验室于2010 年从71 例布鲁氏菌疑似病人血培养标本中分离获得33 株布鲁氏菌，经血清及生物噬菌体分型鉴定，均为羊种布鲁氏菌。

核酸提取应用QIAGEN EZ1 全自动核酸提取工作站( 德国QIAGEN 公司) ，PCR 产物电泳使用QIAxcel 全自动核酸分析系统 ( 德国QIAGEN 公司) ，引物、Premix Ex Taq 体系均来自大连宝生物生物技术有限公司。

重复序列) 分型方法，引物序列、扩增体系及反应条件见文献^[2]。16 个引物分为2 组: panel 1 ( Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、 Bruce43、Bruce45、Bruce55 ) ，panel 2A ( Bruce04、 Bruce07、Bruce09 ) ，panel 2B ( Bruce16、Bruce18、 Bruce19、Bruce21、Bruce30) 。MLVA 反应体系包括10x 缓冲液( mg2 + 1.5 mol /L ) 2.5 μL，dNTP ( 2.5 mmol /L) 1.6 μL，Taq 酶( 2.5 U/μL) 0.2 μL，引物( 10 pmol /μL) 各0.4 μL，DNA 模板1 μL，用灭菌蒸馏水补至25 μL。扩增参数: 95 ℃ 预变性5 min，然后以95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，进行40 个循环。PCR 产物电泳使用QIAxcel 全自动核酸分析系统电泳，得到产物片段的大小。

采用Excel 2003 软件对2010 年辽宁省布病疫情资料进行统计分析。根据PCR 产物大小换算为重复单位数，采用Bio Numerics 4.0 软件，利用非加权配伍组平均法( unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA) 聚类分析，将获得的分型与Brucella 2007 数据库在线比较。

辽宁省2010 年报告病例为606 例，发病率为1.40 /10 万。人间布病发病时间主要集中在3—7 月，报告发病数为337 例，占全年发病数的62.21%，与从事畜牧业生产有关。2010 年，辽宁省发病率居于前3 位的地区分别为阜新市 ( 11.20 /10 万) 、葫芦岛市( 3.09 /10 万) 、锦州市 ( 2.71 /10 万) 。辽宁省布病发病主要以男性为主，病例主要集中在20 ～ 60 岁的成年劳动力中。2010 年男性病例占79.87% ( 484 /606 ) ，女性病例占20.13%( 122 /606) ，男女性别比为3.97∶ 1。布病发病主要集中在农民，农民病例占全部病例的80.20%( 486 /606) 。

图 1

图 1 33 株布鲁氏菌MLVA 聚类分析图

采用MLVA-16 分型方法对33 株布鲁氏菌进行分析。panel 1 引物扩增结果显示，33 株布鲁氏菌均为基因42 型，属于“东地中海”型。panel 2 引物分为2 组，panel 2A ( Bruce04、Bruce07、Bruce09) 与panel 2B( Bruce16、 Bruce18、Bruce19、Bruce21、Bruce30) 。根据panel 2引物扩增结果计算VNTR 重复次数，经BioNumerics 4. 0 软件聚类分析后，按照相似度90% 划分，33 株菌可被分为7 大基因群( A ～ G 群) ，24 个基因型。 其中，A 群为主要基因型，包含11 个基因型15 株菌，占45. 45%; 其次为C 群，包含7 个基因型9 株菌，占27. 27%; F 群包含2 个基因型4 株菌，占12. 12%; E 群为1 个基因型2 株菌，占6. 06%; B 群、D 群、G 群均为单菌株独立基因型，占3. 03%。

辽宁省人间布病疫情明显呈现扩大蔓延之势，主要与群众从事畜牧养殖生产活动有关，省内外牲畜交易日益频繁，相邻各省均为布病高发区，是导致我省布病疫情上升的一个主要原因。农村牲畜买卖频繁，检疫、免疫无保障，群众缺乏布病防治知识，造成布病近年高发疫情。

目前，基因分型技术广泛应用于各种病原微生物的研究，MLVA 方法是众多基因分型方法中较为成熟的一种^{[3, 4]}。目前该方法已广泛应用于结核分枝杆菌^[5]、炭疽芽孢杆菌^[6]、大肠埃希菌O157: H7^{[7, 8]}以及肠炎沙门菌^[9]等一些细菌的分型分析。本研究采用Le Fleche P 建立的布鲁氏菌MLVA-16 分型引物，对辽宁省2010 年分离到的33 株羊种布鲁氏菌进行分析。结果表明，panel 1 引物扩增结果显示菌株均为基因42 型，即“东地中海”型，这与jiang 等^[10]研究结果一致。根据panel 2 引物扩增结果，33 株菌可被分为7 大基因群( A ～ G 群) 24 个基因型，表明辽宁省目前流行的布鲁氏菌存在丰富的基因多态性，A 群基因型( 45. 45%) 为辽宁省目前主要的流行基因型。从基因型多态性来看，来自朝阳地区的8 株布鲁氏菌广泛分布于6 个基因群的8 个基因型中，菌株之间的亲缘关系较远。从地理位置分析，朝阳市位于辽宁西部，与内蒙古、河北省接壤，是辽宁省的畜牧流动集散地，因此当地分离到的菌株显示出丰富的基因多态性现象。

流行病学资料证实，基因19 型中的17、18 号菌株均来自葫芦岛地区的1 起暴发疫情。基因22 型中的24、28 号菌均来自锦州地区，流调显示2 例病人家的羊群曾有过买卖流动。同属于基因22 型的11 号菌株来自朝阳市，在发病时间上早于其他2 个病例，葫芦岛市与锦州市相毗邻，畜牧交易非常频繁。因此根据实验结果，结合病人发病时间、菌株分离时间、分离地区等流行病资料推断，极有可能是同一传染源( 同一群羊) 造成不同接触者的感染发病。

综上所述，通过MLVA 分析可以及时掌握传染源的流动，尽早的控制、扑灭传染源，为布病的防制提供有力的分子生物学依据，对布病传染源追踪、暴发流行调查等方面具有非常重要的意义。