慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)作为常见心血管类疾病其病因迄今尚未完全阐明。有研究表明炎症介质如白细胞介素1(interleukin-l,IL-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在动脉粥样硬化及并发症的发生、发展中起重要作用,CHF与炎症关系日益受到人们重视^[1]。白细胞介素与慢性炎症的活跃有密切关系。IL-1定位于2q13,包括IL-1α、IL-1β、IL-1RN^{[2, 3]}。IL-1β-511位点位于IL-1β启动子区,存在C到T的多态性,本研究通过检测IL-1β-511C/T多态性在CHF人群和健康人群分布,分析IL-1β基因多态性与CHF发病的相关性,以期从基因水平探讨CHF发病遗传学机制。

(1)病例选择:在辽宁省锦州市中心医院和辽宁医学院附属第一医院选择80例慢性心力衰竭患者作为病例组,其中男性45例,女性35例,年龄范围55~65岁,CHF患者符合以下条件:①CHF诊断参照Framingham标准^[4],心功能纽约心脏病协会分级Ⅱ~Ⅳ级、超声心动图左室射血分数＜45%;②年龄≥18岁;③CHF病史≥3个月。排除标准:严重肝、肾功能不全;严重急性感染或代谢紊乱;急性心力衰竭。(2)对照选择:在上述医院选择经体检排除心血管疾病、严重肝肾疾病、甲状腺疾病及糖尿病的健康人群80人作为健康对照组,男性42人,女性38人。本研究对象间无血缘关系,均知情同意。

取各组受试者前臂静脉血5mL,注入装有乙二胺四乙酸抗凝剂的试管中备用,应用小剂量基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取,具体步骤参照说明书进行。

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCRRFLP)法,PCR扩增IL-lβ-511片段,用限制性内切酶Ava I酶切鉴定其基因型。上游引物序列为5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3',下游引物序列为5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3'(大连宝生物公司)。20μL反应体系包括10×PCR缓冲液2μL,dNTP1μL(2mmol/L),MgCl₂(25mmol/L)1μL,上、下游引物各1μL(4μmol/L),基因组DNA 1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,无菌去离子水补充至20μL。预变性94℃5min,94℃30s,52℃50s,72℃1min,共35个循环,最后延伸72℃10min,4℃保存,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,片段大小为304bp。限制性内切酶AvaI酶切反应:取PCR扩增产物5μL,AvaⅠ内切酶2U,10×酶切缓冲液1μL,无菌去离子水补足至总体积10μL,37℃水浴酶切过夜,酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像系统直接读取基因型结果。其中等位基因C由于存在Ava I酶切位点而出现190和114bp2个片段,等位基因T由于酶切位点消失而不能被切开,仍为304bp片段。结果有3种可能基因型,即CC基因型为2条片段(190、114bp),CT基因型为3条片段(190、114、304bp),TT基因型为1条片段(304bp)。

采用SPSS 11.0软件进行处理,计算各组IL-lβ-511基因型及等位基因频率,经HardyWeinberg遗传平衡定律检验,CHF组与健康对照组间等位基因频率及基因型频率的比较采用χ²检验,将杂合子CT和纯合子TT数据合并,再与纯合子CC数据进行比较,并以OR及95%CI表示相对风险度,P＜0.05为差异有统计学意义。

图 1

注: M: markerl; 1 ～ 5: 分别为不同样本。 图 1 IL-lβ-511 PCR扩增结果

基因组DNA经试剂盒提取效果较好。基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统中观察,目的片段大小为304bp。

图 2

注: M: Marker; 1 ～ 4: 分别为不同样本。 图 2 IL-1β-511/AvaⅠ基因分型结果

IL-lβ-511 PCR产物经限制性核酸内切酶AvaⅠ酶切,3%琼脂糖凝胶电泳,基因型结果显示,1号样本3条带,分别为190、114、304bp,基因型为CT;2、4号样本仅有304bp条带,基因型为TT;3号样本2条带,分别为190、114bp,基因型为CC。

表 1

表 1 2组人群IL-lβ-511/AvaⅠ基因型频率及等位基因频率

表 1 2组人群IL-lβ-511/AvaⅠ基因型频率及等位基因频率

CHF组基因型以TT为主,健康对照组以CC基因型为主,差异有统计学意义(OR=2.008,95%CI=1.049~3.884);CHF组以T等位基因为主,频率为56.25%,健康对照组以等位基因C为主,频率为61.25%,差异有统计学意义(χ²=9.825,P＜0.05)。

IL-1β是IL-1家族的一种激动剂,由各种有核细胞所分泌,主要参与局部炎症和细胞内事件调节。有研究显示IL-1β+3953等位基因2阳性基因型可能与中重度成人牙周炎易感性有关^[5]。IL-1β通过识别靶细胞上受体而产生生物学效应。研究表明局部和全身炎症在动脉粥样硬化及其CHF发生发展中起重要作用。炎症介质如IL-1和TNF-α均可促进低密度脂蛋白与内皮细胞、平滑肌细胞结合,启动细胞内一系列反应过程和炎症细胞因子产生。张源明等^[6]研究发现IL-1β-511位点C/T基因多态性与冠心病严重程度存在相关,其机理可能是该位点DNA变异影响了IL-1β分泌加重了炎症反应及血脂紊乱。本研究结果显示,大部分CHF组患者基因型为CT或TT,且其携带T等位基因频率明显高于健康对照组,其患病风险也明显增加。提示IL-1β-511C/T多态性与CHF发病具有一定相关性,等位基因T可能为CHF发病易感基因,其机理可能与该位点DNA变异、影响IL-1β分泌、加重炎症反应有关。