中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (12): 1599-1601   PDF    
引用本文
王雨, 范美, 高英伟, 伏蓉. 镉对人肝癌细胞增殖及凋亡影响[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(12): 1599-1601.
WANG Yu, FAN Mei, GAO Ying-wei, et al. Proliferation and apoptosis of SMMC-7721 induced by cadmium and its mechanism[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(12): 1599-1601.
镉对人肝癌细胞增殖及凋亡影响
王雨, 范美, 高英伟, 伏蓉    
沈阳医学院护理学院, 辽宁沈阳110034
收稿日期: 2012-07-05.
基金项目: 辽宁省博士启动基金资助项目(20091082)
作者简介: 王雨(1973- ),女,辽宁沈阳人,副教授,博士,研究方向:重金属毒性机制及防治。
摘要: 目的 研究镉对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法 体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721分别以0、40、80、160μmol/L的CdCl2处理0～48 h,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,分光光度法检测半胱天冬酶Caspase-3酶活性的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(western blot)法测Caspase-3 mRNA和蛋白表达的变化。结果 随着镉处理浓度的增加,氯化镉对细胞活力的抑制作用明显增强,40、80、160μmol/L氯化镉处理SMMC-7721细胞,其抑制率分别为33.94%、48.04%和68.54%,均明显高于0μmol/L氯化镉处理组,差异均有统计学意义(P＜0.01);40、80、160μmol/L镉处理组细胞的凋亡百分率分别为(25.77±4.66)%、(34.97±9.25)%和(55.14±5.67)%,与0μmol/L镉处理组比较明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01);镉处理SMMC-7721细胞24和48 h,Caspase-3相对酶活性均随着镉浓度的增加而明显增强;40μmol/L镉处理SMMC-7721细胞,12、24和48 h可明显上调细胞中Caspase-3基因及蛋白的表达,Caspase-3基因mRNA表达水平分别为对照组的4.1、3.7和3.9倍,Caspase-3蛋白表达分别为对照组的5.8、6.0和7.2倍。结论 镉能明显抑制人肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,Caspase-3基因在镉诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中起着重要的作用。
关键词: 镉     人肝癌细胞株SMMC-7721     凋亡     基因表达    
Proliferation and apoptosis of SMMC-7721 induced by cadmium and its mechanism
WANG Yu, FAN Mei, GAO Ying-wei, et al    
Nursing School of Shenyang Medical College, Shenyang, Liaoning Province 110034, China
Abstract: Objective To study the effection on proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells induced by cadmium and its mechanism.Methods SMMC-7721 cells were incubated with 0,40,80,160μmol/L CdCl2 for 0-48 hours.Cell viability was measured by methyl thiazolyl tetrazolium assay(MTT).The occurrence of apoptosis was determined by flow cytometry.Absorption spectrometry was adopted to measure the relative activity of Caspase-3.The expression of Caspase-3 gene in SMMC-7721 cells after treatment with cadmium was determined by the methods of reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and western-blot analysis.Results Cell viability decreased in dose-dependent manner with the dose increase of cadmium.The inhibition ratio of cell proliferation incubated with 40,80,160μmol/L CdCl2 was 33.94%,48.04%,and 68.54%,respectively.Compared with 0μmol/L cadmium,the inhibition ratio increased obviously(P < 0.01).The apoptosis rate of SMMC-7721 cell incubated with 40,80,160μmol/L CdCl2 was 25.77±4.66%,34.97±9.25%,and 55.14±5.67%,respectively.Compared with 0μmol/L cadmium,the apoptosis rate increased obviously in the incubated cells with 40,80,160μmol/L cadmium(P < 0.01 for all).With the dose increase of cadmium,we found that the enzyme activity of Caspase-3 increased obviously.RT-PCR analysis revealed that the incubated cell with 40μmol/L cadmium for 12,24 and 48 hours,the expression of Caspase-3 mRNA was 4.1,3.7, and 3.9 times higher compared with that of the controls.Western blot analysis revealed that in the incubated cells with 40 μmol/L cadmium for 12,24,and 48 hours,the expressin of Caspase-3 was 5.8,6.0,and 7.2 times higher compared to that of the controls,respectively.Conclusion CdCl2 can obviously restrain the proliferation and induce apoptosis of SMMC-7721 cell.The results suggest that Caspase-3 could play an important role in cadmium-induced cell apoptosis.
Key words: cadmium     human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721     apoptosis     gene expression    

肝癌是世界上第六大恶性肿瘤,其死亡率高,预后较差[1]。肝癌的化疗药物因其在疗效、副作用以及肿瘤细胞的耐药性等方面的问题,使其临床应用受到一定限制,因此,从不同途径寻找高效低毒的抗肿瘤药仍是当务之急。镉是一种重金属毒物,镉对细胞凋亡和肿瘤的发生具有双重性[2],本研究观察氯化镉(CdCl2)对人肝癌细胞的抑制和诱导凋亡作用,并采用分光光度法、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白印迹(western-blot)方法,从酶活性、基因和蛋白表达几个方面观察镉诱导细胞凋亡过程中半胱天冬酶Caspse-3的作用,为研究镉诱导人肝癌细胞凋亡的机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

人肝癌细胞SMMC-7721购自中国科学院上海生命科学研究院。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,37℃、5%CO2培养箱内培养。

1.2 主要试剂与仪器

RPMI-1640培养液、胎牛血清(美国GIBCO公司);Annexin-Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒(美国BD公司);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium assay,MTT)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)(美国Sigma公司);Caspse-3分光光度法检测试剂盒和BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒(南京凯基生物科技公司);逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒及Caspse-3和β-actin基因引物(日本TaKaRa公司);兔抗人Caspse-3多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。BHC-1300A/B3型超净工作台(苏州苏净集团);BB15型CO2恒温培养箱(美国Thermo公司);SUNRISE酶标仪(瑞典Tecar公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);PCR扩增仪(德国Biometra公司);BIS303PC成像系统(以色列DNR公司)。

1.3 方法 1.3.1 细胞活性的测定

细胞活性的测定用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,参照文献[3],按公式计算镉对SMMC-7721细胞的抑制率。

1.3.2 细胞凋亡百分率检测

细胞凋亡百分率的检测用流式细胞术(flowcytometry,FCM)Anexin-VPI双染法,分别以含终浓度为0、40、80、160μmol/LCdCl2的1640培养液处理24h,制成单细胞悬液;按照试剂盒说明分别加入2种染料,BD-FACScan型流式细胞仪进行检测,CellQuest 3.0采集软件进行数据处理。

1.3.3 Caspse-3酶活性测定

采用分光光度法测定Caspse-3酶活性,细胞以0、40、80、160μmol/L氯化镉分别处理24、48h,每组设6个平行孔,按照试剂盒说明操作并计算Caspse-3活性=实验组A405值/对照组A405值。

1.3.4 基因表达水平测定

采用RT-PCR法测定基因表达水平,细胞传代生长约70%后,无血清培养液培养24h,实验组以40μmol/L氯化镉分别处理6、12、24、48h,对照组以无血清培养液培养48h。PCR引物序列:Caspse-3-sense:5'-CTCGGTCTGGTACAGATGTCGATG-3',Caspse-3-antisense:5'-GGTTAACCCGGGTAAGAATGTGCA-3',扩增片断534bp。β-actin-sense:5'-CTCACCCTGAAGTACCCCATCGA-3',β-actin-antisense:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3',扩增片断450bp。Caspse-3PCR反应条件:94℃2min,1个循环,94℃30s,56/60℃30min,72℃30s,30个循环,72℃延伸6min。实验按照试剂盒说明书操作,产物经2%琼脂糖凝胶电泳后成像分析。

1.3.5 Caspse-3蛋白表达检测

采用Westeronblot法检测Caspse-3蛋白表达,细胞传代生长约70%后,无血清培养液培养24h,细胞分组方法同1.3.4,吸弃培养液,按照试剂盒说明书操作,显色30min后成像分析。

1.4 统计分析

实验所得数据以x ± s表示,用SPSS 13.0软件采用单因素方差分析方法进行组间差异的显著性检验,两两比较用SNK-q检验。

2 结果 2.1 镉对人肝癌细胞SMMC-7721活性的抑制

分别以0、40、80、160μmol/L的氯化镉处理SMMC-7721细胞24h,结果显示随着氯化镉浓度的增加,对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的抑制率明显增加,40、80、160μmol/L氯化镉处理组SMMC-7721细胞的抑制率分别为33.94%、48.04%和68.54%,均明显高于0μmol/L氯化镉处理组,差异均有统计学意义(t=4.085、13.760、16.450,P＜0.01)。

2.2 镉对人肝癌细胞SMMC-7721凋亡百分率的影响

不同浓度氯化镉处理SMMC-7721细胞24h,Anexin-V-PI双染法检测各组细胞凋亡百分率,结果显示,0μmol/L氯化镉组细胞凋亡率为(4.48±1.03)%,40、80、160μmol/L氯化镉组细胞凋亡率分别为(25.77±4.66)%、(34.97±9.25)%和(55.14±5.67)%,与0μmol/L氯化镉组比较,40、80、160μmol/L氯化镉处理组细胞凋亡率均明显升高(t=9.230、12.274、21.632,P＜0.01)。

2.3 镉对人肝癌细胞SMMC-7721 Caspse-3酶活性影响(表 1)
表 1 氯化镉处理对人肝癌细胞SMMC-7721 Caspase-3酶活性的诱导作用

不同浓度的氯化镉分别处理SMMC-7721细胞24、48h,结果显示随着氯化镉浓度的增加,人肝癌细胞SMMC-7721 Caspse-3酶相对活性明显增加,并呈现一定的剂量-反应关系。

2.4 镉对人肝癌细胞SMMC-7721 Caspse-3基因mRNA表达的影响(图 1)
注: M: Marker; 1: 对照; 2: 镉处理 6 h; 3: 镉处理 12 h; 4: 镉处理 24 h; 5: 镉处理 48 h。 图 1 RT-PCR法检测SMMC-7721细胞Caspase-3基因mRNA水平

以40μmol/L氯化镉分别处理SMMC-7721细胞6、12、24、48h,RT-PCR法检测SMMC-7721细胞Caspse-3基因mRNA表达。结果显示,与0μmol/L镉处理组比较,40μmol/L镉处理SMMC-7721细胞,6、12、24、48h可见Caspse-3基因mRNA水平增高,其灰度值分别为对照组的1.1、4.1、3.7和3.9倍。

2.5 镉对人肝癌细胞SMMC-7721Caspse-3蛋白表达的影响(图 2)
注: 1 对照; 2 镉处理 6 h; 3 镉处理 12 h; 4 镉处理 24 h; 5 镉处理 48 h。 图 2 Western-blot法分析Caspase-3蛋白20kDa活性亚单位表达水平

Caspse-3相对分子质量20000的活性亚单位在40μmol/L镉处理12h时被激活,^12、24和48h逐渐增强,其灰度值分别为0μmol/L镉处理组的5.8、6.0和7.2倍。

3 讨论

1996年Waalkes等[4]偶然发现了镉的抗肿瘤作用,此后的研究显示,镉在体内和体外均具有一定的抗肿瘤作用[5, 6],从而对镉抑制肿瘤细胞机制的研究也逐渐成为重点。

Caspase家族被认为是诱发和执行凋亡最为关键的信号分子[7],是细胞凋亡诸多调控通路的关键,本研究发现,一定剂量的镉诱导肝癌细胞凋亡过程中伴随着Caspse-3基因和蛋白表达增强,Caspse-3的酶活性亦明显增高,这与邢安辉等[8]的研究一致,提示镉可能通过Caspse-3途径诱导人肝癌细胞凋亡。镉诱导人肝癌细胞凋亡率的明显提高与镉对Caspse-3酶活性的诱导作用相一致,Caspse-3基因mRNA和蛋白的表达也与镉诱导的人肝癌细胞凋亡存在良好的相关性,提示半胱天冬酶Caspse-3在镉诱导肝癌细胞凋亡过程中发挥了一定的作用,而凋亡有助于清除肿瘤细胞,实现抗肿瘤作用,这为肝癌的临床辅助治疗提供新的思路,重金属镉在体内抑制肝癌细胞的同时对正常肝细胞的影响还有待进一步研究。

参考文献
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[5] 徐艳玲,杜海英,金明华,等.氯化镉对裸鼠皮下移植人肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用及其对线粒体酶的影响[J].吉林大学学报:医学版,2011,37(1):56-58.
[6] 刘晓梅,金明华,杜海英,等.氯化镉和顺铂联合对人肝癌细胞增殖的抑制作用[J].癌变·畸变·突变,2008,20(2):100-102.
[7] 戴昕,李占全,冀标华.凋亡相关蛋白Caspase研究进展[J].中国现代医药杂志,2010,12(4):130-132.
[8] 邢安辉,桂国平,赵洪礼,等.肿瘤特异性凋亡基因诱导人宫颈癌细胞凋亡作用[J].中国公共卫生,2011,27(1):59-60.