中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (12): 1597-1599   PDF    
引用本文
沈杰, 夏玮, 万延建, 许冰, 李媛媛, 徐顺清. 全氟辛烷磺酸促大鼠肝脏NQO1甲基化作用[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(12): 1597-1599.
SHEN Jie, XIA Wei, WAN Yan-jian, et al. Prenatal exposure to PFOS alters individual genes NQO1 promoter methy-lation levels of liver in postnatal SD rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(12): 1597-1599.
全氟辛烷磺酸促大鼠肝脏NQO1甲基化作用
沈杰, 夏玮 , 万延建, 许冰, 李媛媛, 徐顺清    
华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究所教育部重点实验室, 湖北武汉430030
收稿日期: 2011-09-07.
基金项目: 国家自然科学基金(21177046)
作者简介: 沈杰(1962- ),男,江苏吴江人,讲师,硕士,研究方向:分子毒理。
通讯作者: 夏玮,E-mail:26110072@qq.com
摘要: 目的 探讨基因启动子甲基化水平与全氟辛烷磺酸(PFOS)诱导的肝毒性早期过程相关性。方法 在雌性SD大鼠受孕后2～21 d采用PFOS(0.1、0.6、2.0 mg/kg)灌胃染毒;在子鼠出生后21 d收集肝脏组织样本,用亚硫酸氢钠测序聚合酶链式反应法(BSP)结合质粒克隆后测序,检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸:醌氧化还原酶1(NQO1)和肉毒碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)基因启动子区域甲基化状态。结果 与对照组(0%)比较,高剂量PFOS组子鼠肝脏NQO1基因甲基化状态有所上升,-573、-523、-507 3个位点分别升高了10%,而中低剂量组无变化(均为0%);CPT1A基因启动子区域甲基化状态无明显变化。结论 出生前暴露于PFOS的子鼠肝脏中NQO1基因启动子甲基化水平升高。
关键词: 全氟辛烷磺酸(PFOS)     大鼠     NQO1     启动子甲基化     孕期暴露    
Prenatal exposure to PFOS alters individual genes NQO1 promoter methy-lation levels of liver in postnatal SD rats
SHEN Jie, XIA Wei , WAN Yan-jian, et al    
Institute of Environmental Medicine, Key Laboratory of Education Ministry, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuban, Hubei Province 430030, China
Abstract: Objective To examine the possibility of early epigenetic alteration in perfluorooctane sulphonate(PFOS)-exposed rat liver.Methods Pregnant Sprague-Dawley(SD)rats were exposed to PFOS at doses of 0.1,0.6, and 2.0 mg/kg/d and 0.05% Tween 80 as control by gavage from gestation day 2 to 21.The dams were allowed to give birth and liver samples from weaned(postnatal day 21)offspring rats were analyzed for individual genes such as NAD(P)H:quinone oxidoreductase(NQO1)and carnitine palmitoyltransferase 1A(CPT1A)promoter methylation level.Results In PFOS exposed weaned rats,compared to the control,methylation of critical CpG sites in NQO1 promoter was found up to 10% methylated in the livers of treated rats.Conclusion Early induced hypermethylation in critical cytosines within the NQO1 gene promoter region may be a significant biomarker of hepatic PFOS burden,though their direct role in PFOS induced-hepatotoxicity,including its potential carcinogenic action,needs further research.
Key words: perfluorooctane sulfonate(PFOS)     rat     NQO1     promoter methylation     prenatal exposure.    

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulphonate,PFOS)是一种持续性有机污染物,可通过食物链富集,诱导多种毒效应[1, 2];肝毒性和发育毒性是近年来研究热点[3]。它能通过胎盘屏障,引起发育毒性[4]。研究表明,出生前暴露于不良因素和出生后的健康效应相关[5]。近年很多研究着力于寻找与环境因素相关的表观遗传效应,尤其非遗传毒性物质,而PFOS就是一种非遗传毒性物质[3, 4, 5]。其中,基因启动子甲基化状态改变常被作为早期诊断生物标志物[5]。本研究主要以基因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]和肉毒碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)为指标,观察PFOS孕期暴露是否与出生后断乳期大鼠肝脏某些基因启动子甲基化状态改变有关。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

PFOS(瑞典FlukaChemical公司);MJ research PTC-100 PCR扩增仪(美国MJ research公司);BioPhotometer 6131核酸定量测定仪(德国Eppendoff公司);ABI-3130xl测序仪(美国Applied Biosystems公司);DNA提取试剂盒(大连宝生物公司);亚硫酸氢钠和氢醌(美国Sigma公司);引物由上海生工生物试剂公司合成;Go HS Taq DNA聚合酶,琼脂糖凝胶回收试剂盒(美国Promega公司);克隆载体pCRII TA cloning试剂盒(美国Invitrogen公司);DNA Marker、感受态细菌Top10、异丙基-B-D-硫代半乳糖(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(x-gal)(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 实验动物

选用SPF级11周龄SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。饲养于湖北省疾病预防控制中心SPF动物房[许可证号SYXK(鄂)2008-0014]。鼠笼和鼠饮水瓶为聚丙烯材料,不含PFOS等相关物质。实验动物室温度22~25℃,湿度30%~40%,光线12/12h循环。常规饲料和饮用水由湖北省疾病预防控制中心的实验动物中心提供。

1.3 动物分组与处理

适应7d后,雌雄大鼠按2:1合笼,阴道涂片法检查精子阳性与否,检出当天记为受孕0d,将孕鼠分为对照(0.05%Tween20)和PFOS低、中、高剂量组(0.1、0.6、2.0mg/kg),于受孕2~21d对孕鼠进行灌胃染毒,根据母鼠体重增长调整灌胃用量;孕鼠自然分娩。哺乳期间停止对母鼠染毒。出生后随机择取每窝6只,使之继续生长至断乳期,其余仔鼠弃去。待仔鼠断乳时(出生后21d)收集肝脏组织样本,冻存于-80℃,备检。多聚甲醛固定肝脏组织,石蜡包埋,切片4μm,苏木素-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色。光学显微镜下观察切片。

1.4 亚硫酸氢钠处理

用试剂盒提取基因组DNA,放-20℃备用。亚硫酸氢钠处理,对修饰后DNA纯化,加入NH4OAc还原碱基,加NaOH中和,之后乙醇沉淀DNA,干燥后重悬于20μLTE[10 mM Tris-HCl(pH8),0.1 mM EDTA],-20℃备用[6, 7]。

1.5 基因克隆测序

采用亚硫酸氢钠测序聚合酶链式反应法(bisulfite sequencing polymerase chain reaction,BSP),NQO1(385bp)上下游引物分别为:5'-TTT GGT TTT TTG GAG GGT TAT ATA G-3',5'-CAA CTA CTC CCT ATC CAA AAT CTT CTA-3';退火温度为55℃。CPT1A(308bp)上下游引物分别为:5'-GTG TTG GTA GGT TGT TTT GTT GTA T-3',5'-CAA ATC AAA ACT ACA AAT TCA AAA C-3',退火温度为53℃。PCR产物电泳,纯化回收;与克隆载体连接、转化,复苏细菌;涂布,37℃过夜,筛选。挑单白色菌落(每个产物挑10个克隆)接种于液体培养基中;37℃摇过夜,送华大基因武汉分部测序(Applied Biosystems 3730xl)。

1.6 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析,用χ2检验比较基因启动子甲基化水平在剂量组和对照组之间差异。当P＜0.05时,认为组间差异有统计学意义。

2 结果 2.1 PFOS对肝脏细胞形态影响

经过PFOS胚胎早期暴露后,出生后子鼠肝脏光学显微镜下未观察到病理学改变,无肝细胞肿大、空泡化等现象发生。

2.2 NQO1甲基化状态及基因表达(图 1)
注: 图为代表性测序图，反应PFOS暴露后大鼠肝脏 NQO1启动子区域准关键
CpG位点(-523、-507)改变。 图 1 大鼠NQO1的调控区域序列及PFOS暴露后改变状况

检测结果显示,与对照组比较,高剂量PFOS组子鼠肝脏中NQO1基因(-573、-523、-507位点)甲基化状态有所升高,达10%(P＜0.05),中低剂量组无明显改变(P>0.05)。

2.3 CPT1A甲基化状态及基因表达(图 2)
图 2 各组子鼠肝脏组织中CPT1A启动子区域甲基化状态(测序代表图)

表达谱芯片结果提示PFOS暴露后,表达改变最明显的2个基因中另一个是CPT1A。CPT1A的BSP检测结果显示实验组和对照组子鼠肝脏中启动子区域均未甲基化。

3 讨论

PFOS有生物累积效应,在人体中含量相当高:PFOS在职业和非职业暴露人群血清中浓度分别达到了2440和55.8μg/L(最大均数)[1]。其在人体中半衰期(5.4年)远大于在大鼠体内半衰期(100d),人类暴露后果堪忧[3]。PFOS胚胎期暴露后,大鼠肝脏发生了分子水平改变[6, 7];包括某些基因调节区域甲基化状态改变,这些基因可通过表观遗传效应在细胞代谢外来化合物或者相关调控方面起作用[6]。

研究表明NQO1和CPT1A是PFOS暴露后子鼠肝脏表达改变最明显的2个基因[8]。本研究结果显示,高剂量组中,NQO1有2个CpG位点甲基化发生在同一克隆上,这反映基因组同一个拷贝原始甲基化状态;甲基化发生在一个克隆上更容易发挥抗转录因子结合效应。文献报道,这种毗邻甲基化DNA序列易于诱导强力转录抑制因子结合,如甲基化结合区(5-methyl-CpG-binding domain,MBD)[9],其诱导结合能力强于不同拷贝上散在/毗邻甲基化CpG位点。

参考文献
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