蛋白酶体是一种巨型蛋白质复合物,普遍存在于真核生物和古菌中,也存在于某些原核生物中^[1]。细胞内除溶酶体之外,蛋白酶体是主要的蛋白降解途径^[2],其具有多种催化功能,可以选择性地降解细胞内不需要或受损的蛋白质,对于细胞代谢、基因表达调控、氧化应激等多种生物途径起着非常重要的作用^[3]。目前对蛋白酶体的认识主要来自于真核生物,其中结核分枝杆菌被认为是唯一具有蛋白酶体的病原性细菌^[4]。近年来,由于结核病合并艾滋病感染增多、耐药及耐多药结核病流行等多种原因,使结核病的发病率仍居高不下,也成为结核病控制规划实施的重大障碍^[5],因此,急需开发新型的抗结核药物以降低结核病的发病率。有研究表明,结核分枝杆菌蛋白酶体被认为是开发新型药物的潜在靶标^[6]。为此,本研究对结核分枝杆菌蛋白酶体的研究进展综述如下。

真核生物蛋白酶体为26S颗粒,包含1个20S核心颗粒(core particle,CP)和2个19S调节颗粒(regulatory particle,RP),其中20S核心颗粒为蛋白质降解中心,19S调节颗粒则是对底物进行泛素化修饰^[1]。从结构上看,蛋白酶体由4个7圆环堆积构成的桶状复合物,其中间为贯穿整个颗粒的孔道,是蛋白质水解反应发生的场所。从组成上看,4个7圆环中外侧的2个环各含有7种不同的α亚基(α1~α7),α亚基无催化活性;内侧的2个环各含有7种不同的β亚基(β1~β7),β亚基具有催化活性,每个β环含有3种不同的蛋白水解活性位点。在哺乳动物中,β1、β2和β5亚基具有催化作用^[6],且各自具有不同的底物特异性,分别为肽谷氨酰基肽水解酶样活性、胰蛋白酶样活性、糜蛋白酶样活性^[7]。底物需通过α环的中心孔道进入20S蛋白酶体内部,激活催化位点,从而对底物进行降解。19S RP由17或18个亚基组成,位于20S蛋白酶体两侧^[8],由多个有和无三磷酸腺苷酶(adenosinetriphosphatase,ATP酶)活性的亚基组成,对底物泛素化及α环口开启及结合多聚泛素蛋白有重要作用。19S RP能特异性识别并结合泛素化的靶蛋白,依赖ATP酶改变靶蛋白构象,使其发生变性或"展开",能够进入20S催化亚单位的"催化室",进而被水解成各种长度的小分子多肽。在此过程中,19SRP标记并结合靶蛋白的泛素释放到胞质中,可以循环重复使用^{[3, 9]}。19S调节颗粒结合在20S蛋白酶体的两端,可以使孔道开放且与对底物高度选择性有关。

结核分枝杆菌蛋白酶体的20S核心颗粒在结构上与真核生物相似,同样为由4个7圆环构成的桶装复合物,但是由7个相同的α亚基和7个相同的β亚基构成的,在组成上与真核生物存在一定的差异^[4]。结核分枝杆菌蛋白酶体的20S核心颗粒是由prcA编码的7个相同α亚基和prcB编码的7个相同β亚基聚合而成。蛋白水解发生在β亚基N-端的苏氨酸上^[10]。结核分枝杆菌蛋白酶体也具有半胱天冬蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性^{[11, 12]},这些特异性与真核生物蛋白酶体相似,但与其他原核生物相比糜蛋白酶的特异性更强,然而单一的β亚基如何对应于广泛的蛋白酶活性目前尚不清楚。位于外侧的2个α环形成底物蛋白通道,主要参于底物识别,起到"门"的作用^[3],α环既可以使特定蛋白选择性进入蛋白酶体,同时又可阻止胞内非目的蛋白质进入20S颗粒而降解破坏。有研究表明,α亚基N端8个氨基酸缺失与否对蛋白酶体的底物选择性和活性起到至关重要的作用,如缺失可提高蛋白酶体对底物降解的活性等^[11]。

在真核生物中,对蛋白质进行识别是通过泛素连接酶与蛋白质共价结合,使错误或受损蛋白质被识别后进入26S蛋白酶体进行降解^{[13, 14]}。而原核生物蛋白酶体所识别的蛋白质是经泛素化还是类泛素化以及蛋白酶体是如何定向选择待降解的蛋白质目前尚未明确。真核生物泛素化是通过泛素分子的赖氨酸与蛋白质进行共价结合,而原核生物的类泛素化则可能是蛋白酶体进行蛋白水解的激发点^[14]。应用结核分枝杆菌-大肠杆菌细菌双杂交系统,Pearce等发现了第1个原核生物类泛素蛋白质Pup,是一个由64个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白可以对结核分枝杆菌待降解的蛋白质进行识别和修饰,然后进入结核分枝杆菌蛋白酶体进行降解^[15]。经BLASTP分析,发现Pup同系物仅存在于放线菌中,从基因排列结构推测Pup可能与结核菌蛋白酶体编码基因prcBA位于同一操纵子内^[16]。尽管Pup和泛素大小相似,且类泛素化在酶作用底物上与泛素化相类似,均可以与小分子修饰因子共价结合从而使被标记蛋白进入蛋白酶体进行降解,但经氨基酸序列对比发现Pup与泛素分子在结构和氨基酸排列顺序上存在较大差异^{[17, 18]}。如Pup C端的3个残基是甘氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺,而泛素C末端残基则为甘氨酸-甘氨酸。另外在作用方式上,Pup区别于泛素,不是通过蛋白水解作用暴露出C端的甘氨酸-甘氨酸,而是通过C端的谷氨酰胺共价结合于目的蛋白^[19]。

结核分枝杆菌蛋白酶体与细菌致病性的关系密切,结核分枝杆菌通常定居于巨噬细胞内,巨噬细胞溶酶体的酸性环境、活性氮中间物(reactive nitrogenintermediates,RNI)以及感染部位炎细胞聚集所造成的营养和氧的匮乏使得细菌进入非增殖状态^{[20, 21, 22]}。在结核分枝杆菌处于非增殖状态时,由于宿主巨噬细胞产生的诸如NO等化合物可破坏细菌的某些蛋白,当破坏的蛋白因不能及时清除而积累到一定程度时,将导致细菌死亡。此状态下细菌仍能继续存活的重要原因在于细菌可以通过自身的蛋白酶体清除受损蛋白质,从而使之在宿主巨噬细胞内仍能存活并继续保持休眠状态^[23]。同时,无论在体内外进行培养繁殖,蛋白酶体对结核分枝杆菌的营养提供和持续生长均有巨大作用^[24],其作用表现为抵抗NO的损伤^{[22, 24]},即对活性氧和活性氮损伤蛋白的清除;对参与脱毒蛋白的剪切(某些蛋白需经过剪切后才有活性),如对控制DNA修复酶基因阻遏蛋白的剪切等^[25]。值得关注的是在体内结核菌所处的环境不仅有NO、活性氧、RNI,还有巨噬细胞酸性环境,这些因素共同干预细菌的生长。此外,细菌蛋白酶体还可通过对转录因子的降解在转录或转录后水平调节细菌分泌蛋白或表面蛋白以应对宿主免疫系统的攻击^[21]。由此可见,蛋白酶体抑制剂的发现可能成为一种全新的治疗结核病的途径^[4]。

结核分枝杆菌的蛋白酶体是某些蛋白降解所必需的成分^{[18, 26]},以在体外氮氧化物压力下细菌的存活^[27]以及在鼠体内的持留^[19]尤为重要。有研究证实蛋白酶体可作为新型药物的作用靶标^[19],目前对结核菌蛋白酶体抑制剂的研究仅见美国康奈尔医学院Carl Nathan领导的研究小组,该小组于2009年9月在Nature杂志上发表的研究论文中称,其发现了一种化合物oxathiazol-2-one具有抑制结核分枝杆菌蛋白酶体的功能,在不损伤哺乳动物细胞情况下能够抑制结核杆菌的休眠机制^[4]。对该抑制剂的结构进行分析,发现该抑制剂是通过直接改变结核分枝杆菌蛋白酶体的蛋白水解酶活性位点来阻断其降解蛋白质功能的^[28]。

综上所述,蛋白酶体对结核分枝杆菌非增殖期的存活具有重要意义。结核分枝杆菌进入人体后,定居于巨噬细胞内,来自于宿主的一系列防御机制使细菌处于非增殖状态。这期间巨噬细胞溶酶体内的酸性环境、活性氮中间物等的攻击可破坏结核分枝杆菌的蛋白质,以使其毙命。结核分枝杆菌通过蛋白酶体及时清除受损蛋白质,使细菌得以存活。因此,结核分枝杆菌蛋白酶体抑制剂的研发可望开辟治疗结核病的新途径。