副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种会引发急性肠胃炎而导致腹泻、头痛、呕吐、恶心、低烧和肠胃痉挛的革兰阴性嗜盐杆菌。副溶血弧菌已经成为导致食源性疾病最主要的细菌,中国、印度、日本、美国及欧洲很多国家都曾有食物中毒暴发案例^{[1, 2]}。副溶血弧菌对人和动物均有较强的毒力,其毒力基因主要为分子量42 000的致热性溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)和分子量48.000的TDH类似溶血毒(thermostable direct hemolysin-related hemolysin,TRH),具有溶血活性、肠毒素和致死作用^{[3, 4, 5]}。中国沿海地区居民常有生食或半生食贝类、甲壳类等海产品的习惯,国家食源性疾病监测网数据也显示,在沿海省份副溶血弧菌引起食物中毒的规模及人群暴露范围呈明显上升趋势,已经居微生物食物中毒首位^[6]。随着对细菌感染研究的日益深入,传统的细菌鉴定技术已不能满足实验室鉴定和流行病学调查的需要,从型、亚型甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要。近年来,随着分子生物学和基因组学的发展,一些分子分型技术,如脉冲场凝胶电泳分型技术(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、多位点序列分型(multilocus sequencing typing,MLST)和多位点可变数目串联重复序列分析(multilocus variable number tandem repeat analysis,MLVA)、随机扩增多态性DNA片段(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、核糖体基因分型(ribotyping)、任意引物聚合酶连反应(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)、扩增片段长度多态性分析技术(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、DNA重复序列PCR技术(Rep-PCR)等,已广泛应用于细菌鉴定、分型溯源、种群结构和遗传进化分析及分子流行病学的调查等方面,并发挥了重要作用^[7]。本研究对副溶血弧菌常见的几种分子分型方法的最新研究进展和应用情况进行如下综述。

脉冲场凝胶电泳是目前国内外流行病学研究广泛接受的方法之一,与其他方法相比,具有重复性好、分辨率高、结果稳定、易于标准化的优点,能在细菌基因组很庞大的情况下,反映较多的变异信息,而且其周期长的缺点已逐渐被快速PFGE方法改善^[8]。PFGE的基本原理是通过电场方向的不断改变,使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA分子的泳动方向做相应改变。小的DNA分子比大的分子变化快,故小分子泳动的快,从而在凝胶上按染色体大小而呈现出不同的电泳带型。DNA带的密度在一定程度上反映了细菌内DNA的含量以及DNA分子的大小,最终达到分型目的^[9]。Parsons等^[10]在文献中详细的描述了3个PulseNet美国公共卫生实验室合作制定规范副溶血弧菌PFGE标准化流程。PulseNet是1998年5月美国CDC在白宫宣布成立的,它利用标准化的细菌实验室分子分型技术、通过全球网络实验室的实际监测和检测,建立网络化平台、数据及时交流、从而调查食源性传染病相关资料,并快速鉴定暴发的来源,在暴发流行的预警、识别、分析和控制中发挥了非常重要作用。中国在2004年9月正式加入了PulseNet网络,成立了PulseNet China实验室,建立了PFGE标准化方案和数据库^[11]。现有VP的PFGE标准化流程是对大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌的标准化流程进行分析、实验的基础上发展而来的。

Kam等^[12]用PFGE方法对分别来自6个实验室的36株副溶血弧菌进行研究,这些菌株分别来自不同地区和不同时期而且血清型也不全相同。用SfiI和NotI 2种限制性内切酶分别对它们进行酶切,发现限制性内切酶SfiI产生的限制性片段的数量范围为14~20,共产生31个图谱型;限制性内切酶NotI产生的限制性片段的数量范围为12~20,共产生32个图谱型。通过6个实验室的共同努力,经多次重复实验证明,使用限制性内切酶SfiI对目标菌株酶切更加快速、便捷。脉冲场凝胶电泳可以有效地监测全球现有的和新兴的大流行株的传播情况,收集的各实验室数据,可以实现共享。Wong等^[13]对在印度、日本、韩国、中国台湾等地收集的分散的205株临床O3:K6血清型VP用PFGE方法进行分型和聚类分析,用限制性内切酶SfiI进行酶切,所有的O3:K6的菌株被分成2个的聚类,共13个带型。PFGE结果显示,1996年以后在中国台湾发现的来自于印度、日本、韩国的菌株形成1个聚类,并且与1996年前分离的O3:K6和非O3:K6菌株均有明显不同,说明新克隆菌株已在全球大范围流行。Liu等^[14]从中国河北省地区采集的海鲜样本中分离到38株副溶血弧菌,利用PFGE技术可将其分成A~E共5大聚类,相似性> 71%。其中聚类E菌株来自于石家庄、保定和廊坊,这些菌株同时耐氨苄青霉素、硫代异二唑、链黑菌素和万古霉素,说明这些菌株是当地克隆流行株,同时也证明VP的PFGE分型结果与耐药性和地理位置有明显关联。

MLST在监测全球的流行病上具有强大的优势,数据重复性好,可在互联网上共享。基本步骤:选定目的基因组的数个看家基因位点,扩增各目的看家基因片断,扩增产物纯化后测定各位点片段的DNA序列,给各基因位点指定相应的等位基因数值,根据菌株每个管家基因的序列信息分配等位基因序号(allele number),把该菌株所有管家基因的等位基因序号合并在一起组成1个等位基因谱(Allelicprofile),并给这个等位基因谱分配1个唯一的编号作为该分离株的序列型(sequence types,STs)^[15]。目前MLST主要用于病原微生物的进化和流行病学分析,鉴定细菌高度克隆谱系,鉴别毒力菌株的大小种群。由于MLST主要是是通过管家基因变异对细菌分型,而细菌的管家基因在进化过程中高度保守(突变积累太慢),所以MLST不能区分高度关联的菌株,对遗传关系相近的不同血清型菌株不能有效鉴别^[16]。副溶血弧菌的7对管家基因序列从PubMLST网络数据库(http://pubmlst. org/vparahaemolyticus/)下载。

Maiden等^[17]通过对从泰国分离的107株不同来源的副溶血弧菌的7对管家基因来研究泰国副溶血弧菌的分子进化和流行病学特点。107株菌(临床菌株37株,环境菌株63株)共有63个STs,其中54个新STs。通过MLST鉴定,发现泰国副溶血弧菌株分型高度多样化;相同的ST型的菌株血清型多样表明在相同聚类中细菌的O抗原和K抗原的基因发生了变异和重组。Yu等^[18]对中国东南沿海地区搜集的71株副溶血弧菌进行MLST分析,共分成61个STs,结合PubMLST中检索到的51个STs分析发现112个STs,根据地域不同和来源不同主要分成4个比较大的分支。其中2个小分支中的6株菌拥有5个STs,发现主要是因为recA位点的不同从而从推测出这些菌株的recA位点发生了横向重组。

MLVA根据被检测菌株散在于基因组中的不同独立位点的数目可变串联重复序列(variable numbertandem repeats,VNTR)重复单元拷贝数的差异来进行基因分型。MLVA分型与血清学分型、PFGE分型相关性好,不仅能够反映菌株间基因水平微小变异,而且方法操作简单、实验周期短、成本低、结果数字化,可通过BioNumerics数据库实现菌株信息交流。但是MLVA分型方法尚处于初步应用阶段,因此可与PFGE 2种方法相互补充。

Kimura等^[19]对从1996-2003年获取的散发人源28株副溶血弧菌进行MLVA分析。这些O3:K6大流行菌株可以分离成28个VNTR型别。数据显示,与其他分型方法相比,MLVA分型方法有分辨率高和重复性好的特点。Harth-Chu等^[20]对来自于智利的81株副溶血弧菌在直接基因组限制酶分析方法(direct genome restriction enzyme analysis,DGREA)上进行MLVA分型研究。该研究筛选了10个VNTR位点,将81株菌分成59个型别,能够在DGREA基础上区别同一聚类的菌株,即能够有效区别亲缘关系很近的菌株。

RAPD技术由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别提出^[21],现已广泛应用于微生物的鉴定、分型及进化关系的研究。基因组的DNA片段缺失、插入或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,扩增产物的多态性反映了基因组的多态性^[22]。RAPD虽没有PFGE分辨力强,可是它具有良好的简便性和快捷性。

Zhao等^[23]对中国东都沿海城市于2008年12月-2009年11月在零售商店收集288份样本进行分离鉴定,共检出172株副溶血弧菌。将所有菌株进行血清型鉴定,其中157株菌分属9种O抗原和42种K抗原;而用RAPD结合SPSS软件构建以上菌株的带型关系系统树状图对其遗传多态性进行评估,结果显示这些菌株共分为73个不同的带型,且其中67个带型可被分成18个聚类。RAPD显示,有几个聚类只存在于特定的几个省,如聚类C、O、Q、R只存在于山东省; L聚类只在福建省出现; F和I聚类从山东省和江苏省分离的;聚类H和M是从江苏、浙江和福建中分离出来,因此,此方法对细菌的分型溯源十分有利。该研究表明,RAPD在副溶血弧菌研究中是一个有效的流行病学的评估方法,还可用于鉴定分析菌株的遗传多态性。

Ribotyping,即核糖体基因分型,是对包含rRNA基因的基因组DNA的限制性片段多态性进行分析。其原理是将细菌DNA用限制性内切酶消化,经凝胶电泳和Southern转印后,用经标记的rRNA基因探针杂交,根据带型的不同对细菌进行分型^[24]。与ERIC-PCR和PARD相比,核糖体基因分型虽然方法比较繁琐,但是具有较高的分辨力且其结果稳定,可用于不同批次实验间菌株的比较和流行病学中菌株的确认。

张蔚^[25]用该技术对杭州一起食物中毒事件的分离菌株进行了分型分析。研究人员用ribotyping、ERIC-PCR和RAPD 3种方法对10株菌分别进行了分型研究,结果显示,用ribotyping分型方法将这10株菌分为2种型别,但是在ERIC-PCR和RAPD的指纹图谱上却未见区别,因此说明ribotyping技术具有更高的分辨力。陈洪友等^[26]对从上海市98株副溶血性弧菌进行核糖体分型,均可产生7~11条带,按其条带相似度(80% cutoff值)可分为5个Ribo型。同一起暴发中相同血清型的菌株其Ribo型相同。

AP-PCR采用单个随意选择的寡核苷酸引物,较低的退火温度下启动新链合成,从而产生具有型、株特异性的DNA扩增片段,经电泳后根据其产生的条带对细菌分型。该方法无需了解待测基因组的碱基序列,不受DNA限制性内切酶的限制,仅需少量基因组DNA,且通过增加随意引物数量,可对任何复杂的生物变异进行基因分析^[27]。AP-PCR基因分型有敏感、快速、重复性好等优点,尤其适合鉴别遗传关系较近的细菌。但是因为不同实验条件对APPCR结果有一定影响,因此必须对实验条件进行严格控制,确定最佳反应条件。

Okuda等^[28]对1994年1月-1996年8月监测的印度加尔各答临床139株副溶血弧菌进行分析,O3:K6的菌株集中出现在1996年2-8月。用APPCR技术和毒力基因检测技术同时对O3:K6的菌株分析显示他们同属于1个克隆群,这些加尔各答的O3:K6的菌株克隆群与1982-1993年其他东南亚旅行至日本所携带的菌株结果相似,表明这些O3:K6菌株向东南亚等地普遍存在。

AFLP技术是以PCR为基础,可以直接通过凝胶电泳来检测基因组DNA的限制性片段长度多态性。它继承了RFLP的可靠性和PCR的优势,具有分辨率高和稳定性好等优点。AFLP技术已发展成为分析多种来源DNA指纹图谱的一项普遍技术,为构建遗传图谱、遗传多样性、品种鉴定等相关领域的研究提供了一个非常有效的工具。不同的生物个体之间由于基因组的序列差异,在进行酶切时产生的片段有相同的也有不同的长度,引物的扩增能够显示出这些相同的和不同长度的片段,从而表现出带型的多样^[29]。

Thompson等^[30]对29株来源于环境和临床的副溶血弧菌用AFLP方法研究环境与临床副溶血弧菌之间的关系。AFLP条带大小在75~500 bp,约90条左右。两株菌vp6和vp23的发现时间虽然相距25年,却发现了相同的AFLP条带图谱,而且都有tdh基因。其中,6株菌的AFLP条带图谱几乎难以区分,表明基因相似性很高。这些副溶血弧菌的gyrB、recA和pgm的基因序列发生重组,说明同源重组是副溶血弧菌进化的重要方式。

Rep-PCR是指扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列,通过电泳条带比较分析,揭示基因组间的差异。细菌基因组中广泛分布的短重复序列(repetitive sequence),包括常用的基因外重复回文序列(repetitive extragenic palindromic,REP)、肠杆菌基因间重复一致序列(enterobacterial repatitive intergenic consensus,ERIc)和细菌基因组重复序列,它们在菌株、种、属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。REP-PCR分辨效果好、可重复性强,操作方便,可对多株菌分型。REP-PCR目前可自动化分型,并可建立各种细菌REP、ERIC-PCR分型标准数据库,实用性强、费用低、可再现性好,目前发展迅速并被广泛应用于多种细菌基因分类^[31]。

Cox^[32]用Rep-PCR方法来检测罗德岛州水域中决定副溶血弧菌遗传和活性的环境因素。通过用Rep-PCR方法对罗德岛州水域中副溶血弧菌的遗传多态性研究发现,水温与牡蛎中副溶血弧菌的tl(thermolabile hemolysin)基因和trh基因呈正相关,与tdh基因呈负相关;除此之外,Rep-PCR研究结果显示罗德岛州水域中的副溶血弧菌具有很高的遗传多态性。丁久法等^[33]用副溶血性弧菌ERIC-PCR技术,分析副溶血性弧菌标准菌株及分离株基因组DNA的ERIC-PCR指纹图谱,并对副溶血性弧菌毒力基因进行检测。发现26株副溶血性弧菌均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,ERIC-PCR可将26株菌分为12个型,分辨力指数为0.926。证明ERIC-PCR可以从分子水平上对副溶血弧菌进行分析,方法集简单、快速、敏感和分辨率高的优点于一身,普遍应用于流行病学中的致病菌株鉴定和确定细菌间的亲缘关系。金莉莉等^[34]利用Rep-PCR和ERIC-PCR对40株临床分离副溶血弧菌基因组DNA进行扩增,对扩增的DNA电泳指纹图谱进行分型分析。结果表明,PEP-PCR方法对40株副溶血弧菌分离株的基因组DNA扩增条带明显多于ERIC-PCR,PEP-PCR方法可以在ERIC-PCR基础上进一步区分菌株,得出PEP-PCR方法比ERIC-PCR具有更好的分型能力。

与传统的血清学分型、营养分型等表型分型方法相比,在发生副溶血弧菌中毒事件时,分子分型方法有着更高的分辨力和敏感性,不仅能够分析不同时期、地区、流行事件中菌株间基因组的相似程度,而且能够结合流行病学,进一步解释其流行的内在规律,为食源性传染病病原的鉴定溯源、新型病原的发现、食物中毒事件的确认及流行病学调查、病原体遗传变异以及种群进化分析提供了技术支持,并为传染病病原分子分型监测网络的建立奠定基础,为食品污染监测提供有益的指标。本研究介绍了8种分子分型方法,为了提高副溶血弧菌分型效率,实验者可结合多种分型方法综合分析,完善数据,使实验结果更具有说服力。