全氟化合物(perfluorinated compounds,PFCs)是一种持久性有机污染物,其代表性物质有全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)和全氟辛烷磺酸基化合物(perfluorooctane sulfonate,PFOS)。全球PFCs年排放量中98%存在于水体中,但是自来水处理系统对PFCs影响甚小^[1],因而进一步完善PFCs的检测方法具有重要意义。目前,国内外对PFCs的检测主要为高效液相色谱质谱联用法(HPLC/MS),但由于仪器昂贵其应用受到限制。过氧化物酶增值激活受体(PPAR)是一类配体激活核转录因子,据文献报道,PFOS和PFOA在生物体内的作用途径是通过PPARα受体介导的^{[2, 3]}。基于PFOS和PFOA与PPARα特异性结合的特性及新型生物标记物量子点的优良属性,本研究采用一种简便的量子点荧光法测定环境水样中PFCs,结果报告如下。

PFOA和PFOS标准品(美国Fluka公司);二甲基亚砜(DMSO) (美国默克公司); Quantum dots streptavidin conjugate(QD-SA) kit(武汉珈源量子点有限公司);高效液相色谱纯化的Biotin标记的双链过氧化物酶体增值激活受体反应元件(PPRE)探针以及相关寡核苷酸序列(上海生工生物技术公司); PPARα单克隆抗体和Poly dI-dC(美国sigma公司);细胞核蛋白提取试剂盒(德国罗奇公司); TECAN Infinite 200酶标仪(美国Tecan公司)和Agilent1100高效液相色谱/Agilent MSD质谱(美国Agilent公司)。

不同浓度PFOA标准品与定量PFOA激活并竞争结合PPARα受体蛋白和维甲酸-X受体α(RXRα)核受体蛋白,形成PPARα-RXRα-PFOA复合物^[4]。该复合物中PPARα受体能特异性识别生物素标记PPRE结合位点,并被PPARα单克隆抗体特异性捕获。利用生物素-亲和素系统(BAS)将链酶亲和素标记量子点(QD-SA)标记在复合物上,在激发波长为400 nm,发射波长为605 nm条件下检测不同浓度组PFOA荧光值。PFOS原理同。

PPARα受体核蛋白按照Baptista等^[5]方法从SD大鼠肝细胞核中提取,分装并于低温冰箱中保存。合成生物素标记PPRE序列(sense:biotin-5'-AAAAACTGGGTCAAA-3',antisense:5'-AGACCTTTGACCCAGTTTTT-3')。离心后将单链探针溶解在无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸-乙二胺四乙酸缓冲液(TE) (10 mmol/L Tris-HCL,1mmol/L EDTA,pH=8.0)中,然后加入退火缓冲液(10 mmol/L Tris-HCL,1 mmol/L EDTA,50 mmol/LNaCl,pH=8.0),利用普通PCR仪杂交成PPRE双链探针。

根据文献^{[6, 7]}方法制备并包被PFOA-BSA复合体,将1 mmol/LPFOA和1.2 mmol/L BSA等体积混匀,加入0.025%葡聚糖包裹的活性炭溶液,30 min后离心取上清液,即所得约为0.5 mmol/L的PFOA-BSA溶液。

PFOA标准品溶于0.05%DMSO中,制备浓度分别为2.5、5.0、12.5、40.0、50.0、75 ng/L标准品溶液,0. 05% DMSO溶液作为对照组。将200 μL不同浓度PFOA标准品和2 μLPPARα受体核蛋白溶液加入到包被PFOA-BSA复合体酶标板中,37℃振荡孵育1.5 h。上清液转移至包被有PPARα单克隆抗体的另一酶标板中,37℃振荡孵育1.5 h后用含吐温20的磷酸盐缓冲溶液(PBS-Tween 20)洗涤。每孔加入100 μL核蛋白结合缓冲液和75 μL纯水,30 min后加入25 μL生物素标记PPRE探针,37℃孵育1 h,PBS-Tween20洗涤。最后加入200 μL 1:1 000稀释QDs-SA,4℃避光孵育2 h,PBS-Tween 20洗涤,待测。

(1)回收率实验:根据检测范围选择低中高剂量水平加标浓度,6个重复回收率实验。(2)重复性试验:对3个水平6个重复回收率测试结果进行变异系数计算。(3)与HPLC/MS法比对:应用所建QDs荧光检测法对环境水样PFCs进行检测,并用HPLC/MS法进行验证。

将聚乙烯材料采样瓶置于长江、东湖以及汉江水面以下20 cm处,各采样点均采集水样3 L,分3份,每份1 L,1份样本,2份实验平行样。选取固相萃取作为样品前处理方法:环境水样分别用滤纸和0.22 μm滤膜去除水中较大颗粒物,通过真空泵以1滴/s的速度流过PresepPFC-Ⅱ固相萃取柱。5.0 mL甲醇洗脱,用氮吹仪吹至近干,1.0 mL甲醇溶解残渣,定容。

测量不同浓度PFOA和PFOS标准品,根据标准品浓度与量子点信号强度变化绘制剂量-效应关系曲线。PFOA和PFOS直线回归方程与相关系数分别为:y_PFOA=17.601x-20.914,r=0.986; y_PFOS=19.112x-23.995,r=0.982。结果显示,二者在2.5~75 ng/L范围内线性良好,检测限均为2.5 ng/L。

方法最低检出限为2.5 ng/L,环境水样最低检出量为10.24 ng/L。选取2.5、12.5、40 ng/L 3个加标浓度回收率为80.89%~120.95%,PFOA与PFOS平均回收率分别为107.8%和110.3%。表明该方法完全可满足PFCs检测要求。3个加标浓度回收实验变异系数分别为12.31%,8.56%,6.93%,显示该方法重复性较好。2.3与HPLC/MS法检测环境水样PFCs比较(表 1)本研究共采集18份样本,分别用QDs荧光检测法与HPLC/MS法进行分析比对。HPLC/MS法检测限为1.0 ng/L,线性相关系数为0.99,PFOA和PFOS回收率分别为105.9%、104.3%。结果中PFCs浓度为PFOS和PFOA总和,2种方法相关系数r=0.99,显示本法与HPLC/MS法相关性良好。

表 1

表 1 PFCs QDs荧光法与HPLC/MS法检测结果比较(ng/L，x±s，n=6)

表 1 PFCs QDs荧光法与HPLC/MS法检测结果比较(ng/L，x±s，n=6)

本研究建立的QDs荧光检测法检测范围为2.5~75 ng/L。研究发现,在中国除广东东莞外,很少有环境污水中PFCs浓度超过100 ng/L报道^[8],因此绝大多数地方水样可直接用QDs荧光法检测。在检测结果超出检测范围时,可对实际水样倍比稀释后检测。鉴于PFOA和PFOS二者在环境中都难以降解且在人体内作用机制一致,以及本研究旨在说明所建方法及其实用性,所测PFCs浓度为PFOS和PFOA总和,而并未将PFOS和PFOA的浓度分别与用HPLC/MS法测定浓度值比较。

QDs荧光检测法是基于PFOA和PFOS能与PPARα特异性结合这一特性提出的,主要用于检测PFOA和PFOS,也可以用于检测作用机制与PPARα有关的PFCs,与传统HPLC/MS法比较,该方法用于环境水样检测是可行性的。在进行PFCs检测时,测得荧光强度与标准品PFCs浓度相关性良好,相关系数> 0.98,检测限为2.5 ng/L,而HPLC/MS法线性相关系数可达到0.99,检测限为1.0 ng/L。与HPLC/MS法比较,QDs荧光检测法技术参数仍有一定差距,准确性和灵敏度有待于进一步提高,原因可能是基于PPAR受体的生物检测方法其灵敏度和准确性受核蛋白受体活性影响。HPLC/MS法运用仪器测量准确度高,但技术要求也较高,且仪器昂贵,从而限制了该方法的普及推广。QDs荧光检测法准确度、检测限等均能满足实际工作需要,操作简单,节省时间和实验耗材;不仅能检测环境水样中PFCs,还可应用于生物样本。实际工作中可一次性检测数百个样本,因此较适合大批量样品检测以及PFCs污染水平筛选。