中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (11): 1520-1522   PDF    
引用本文
匡莹, 仇峰, 杨美华. 枸杞果酒中赭曲霉毒素A液相质谱串联法测定[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(11): 1520-1522.
KUANG Ying, QIU Feng, YANG Mei-hua. Determination of ochratoxin A in wolfberry fruit wine with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(11): 1520-1522.
枸杞果酒中赭曲霉毒素A液相质谱串联法测定
匡莹, 仇峰, 杨美华     
中国医学科学院药用植物研究所, 北京100193
收稿日期: 2011-04-02.
基金项目: 科技部重大新药创制专项(2009ZX09502-025);国家中医药管理局2008年度中医药行业科研专项(200807042)
作者简介: 匡莹(1986- ),女,江西南昌人,博士在读,研究方向:中药质量分析。
通讯作者: 杨美华,E-mail:yangmeihua15@hotmail.com
摘要: 目的 建立测定枸杞果酒中赭曲霉毒素A(OTA)的高效液相色谱-串联质谱法。方法 样品用免疫亲和柱净化,以Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,3.5μm)分离;梯度洗脱流动相:水(含0.1%甲酸)和乙腈(含0.1%甲酸);流速:0.4 mL/min;进样量:10μL;电喷雾正离子多反应监测扫描模式(MRM)检测。结果 该方法的定量限为0.02 ng/mL,在0.02～20 ng/mL内线性关系良好,加样水平分别为0.2、2、20 ng/mL时,其回收率分别为71.0%、83.7%、86.0%,相对标准偏差(RSD)分别为8.0%、9.0%、6.1%;在随机购买的12份市售枸杞果酒中测得OTA的含量为0.03～0.18 ng/mL,检出率为50.0%。结论 赭曲霉毒素A在样品中的测定结果均低于欧盟限量;该方法简便、灵敏、准确,可应用于枸杞果酒中赭曲霉毒素A的测定。
关键词: 高效液相色谱-串联质谱法     赭曲霉毒素A(OTA)     枸杞果酒    
Determination of ochratoxin A in wolfberry fruit wine with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
KUANG Ying, QIU Feng, YANG Mei-hua     
Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Mediccine, Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China
Abstract: Objective To develop a sensitive and accurate method of high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of ochratxoin A(OTA)in wolfberry fruit wine.Methods Samples were cleaned up by immunoaffinity column(IAC)and then separated on Agilent Zorbax SB-C18 column(2.1 mm×50 mm, 3.5μm).Gradient mobile phase was prepared with water(containing 0.1% formic acid)and acetonitrile(containing 0.1% formic acid).Flow rate was set to 0.4 mL/min and the injection volume was 10μL.Liquid chromatography-electrospray ionization-MS/MS(LC-ESI-MS/MS)in multiple reaction monitoring(MRM)was operated under positive electrospray ionization mode.Results The limit of quantification(LOQ)of the method was 0.02 ng/mL.The calibration curves showed a good linearity in the range of 0.02-20 ng/mL.The spiked levels were set at 0.2,2,and 20 ng/mL with the average recoveries of 71.0%,83.7%,and 86.0% and the relative standard deviations(RSDs)of 8.0%,9.0%,and 6.1%,respectively.OTA concentrations in the 12 samples investigated were between 0.03 ng/mL and 0.18 ng/mL,and the detection rate was 50.0%.Conclusion OTA concentrations in the samples investigated were all below the maximum allowable limit established by the European Community.The method was proved to be simple,rapid,sensitive,and suitable for the quantification of OTA in wolfberry fruit wine.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry     ochratoxin A     wolfberry fruit wine    

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)主要是由赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和纯绿青霉(Penicillium viridicatum)产生的有毒代谢产物[1],其广泛存在于各类食品中[2]。目前OTA的分析测定一般采用薄层色谱法、酶联吸附免疫法和高效液相色谱法[3, 4],由于薄层色谱法灵敏度较差,酶联吸附免疫法有假阳性结果等原因,高效液相色谱法是目前应用最广泛的OTA检测方法。枸杞(Lycium barbarum L.)有扶正固本、生精补髓、滋阳补肾等功效[5, 6]。枸杞果酒是以枸杞为原材料酿制而成,其原材料可能受OTA污染。目前,在以中药材为原料的中药酒剂中OTA的污染情况报道较少,为准确检测枸杞果酒中OTA含量,本研究采用高效液相色谱法-患联质谱法对其进行检测。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪(日本岛津公司); API 4000三重四级杆质谱仪(美国应用生物系统公司); Analyst Software 1.5.1色谱工作站、Qilinbeier旋涡混合器、Heraeus Multifuge X3R低温高速离心机、PGG-01D型干式氮吹仪(天津艾维欧科技发展有限公司); 0.22 μm微孔滤器(天津津腾实验设备有限公司); OchraTest免疫亲和柱(美国VICAM公司)。赭曲霉毒素A对照品(美国VICAM公司,1 mg);乙腈、甲醇、丁螺环酮(色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司); NaCl、冰醋酸(分析纯,北京化工厂);实验用水为Millipore纯水系统(美国Beckman公司)制备的高纯水。

1.2 枸杞果酒样品

从北京超市随机购买,均在保质期内,保存于4℃冰箱。

1.3 对照品溶液、内标溶液和磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)配制

精密称取OTA对照品适量,甲醇溶解,配置成10 μg/mL的工作液。溶液避光保存于4℃冰箱,在使用前先放置至室温。精密称取丁螺环酮适量,甲醇溶解,配制成100 ng/mL溶液,作为内标工作液。PBS配制:称取8.0 g氯化钠、1.2 g磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾溶于900 mL水中,用浓盐酸调节pH至7.0,用水定容至1 000 mL。

1.4 样品溶液制备

免疫亲和柱在使用前用10 mL PBS以3~4滴/s通过柱体,完成活化。取5 mL已过0.22 μm微孔滤器的样品,与5 mL PBS混合。排尽免疫亲和柱内的缓冲液,并将混合液以1 mL/min的流速通过亲和柱。之后,用10 mL的蒸馏水清洗亲和柱,小心排尽亲和柱内残留的水分。用2 mL甲醇以1 mL/min进行洗脱,洗脱时让甲醇在亲和柱内停留反应约5 min。洗脱液用氮气40℃定容至1 mL。取上述样品溶液100 μL,加入5 μL丁螺环酮内标工作液,3 000 r/min离心10 min,取上清液10 μL进样。

1.5 液相色谱及质谱条件[7]

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(2.1 mm×50 mm,3.5 μm);流动相:流动相A为水(含0.1%甲酸),流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)。流速:0.4 mL/min。洗脱梯度程序:0.01~0.50 min,5 % B; 0.50~2.50 min,B线性增加至95%; 2.50~2.51 min,B恢复至5%;2.51~4 min,5 % B,结束;进样体积:10 μL。质谱条件:离子源为大气压电喷雾离子源;喷雾电压:5.5 kV;雾化气压力:40 psi;辅助气:60 psi;气帘气压力:12 psi;毛细管温度:550℃;去簇电压:46 eV;碰撞能量:31 eV;正离子检测;扫描方式:多反应监测扫描模式,OTA用于定量分析的离子对为m/z404/239,内标丁螺环酮的离子对为m/z 386/122。

1.6 检测限、定量限及线性关系考察

取标准品溶液,逐级稀释,操作步骤参照1.5,取信噪比(S/N)3:1为OTA的检测限;以信噪比(S/N) 10:1测得其定量限。取对照品溶液以甲醇进行逐步稀释,获得浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5、10、20 ng/mL的标准系列溶液。将逐级稀释的标准工作液各取100 μL,分别参照1.5的步骤操作,测定结果分别以对照品峰面积与内标峰面积的比值对对照品的浓度作线性回归,得相应的回归方程。

1.7 精密度实验

配制低、中和高3个不同浓度的OTA标准溶液(浓度分别为0.5、1和16 ng/mL),各取100 μL,分别参照1.5的步骤操作,每个浓度同一天内测定6次,计算日内相对标准偏差(relativestandard deviation,RSD),每天测定1次,连续测定6 d,计算日间RSD。

1.8 方法的回收率测定

取阴性样品考察方法的回收率,根据欧盟对OTA在酒类产品中的最大限量值,设定3个加样水平[8],分别为0.2、2、20 ng/mL。每个水平重复3次试验。

1.9 样品测定

取12份样品,均参照1.4步骤进行样品溶液制备,参照1.5步骤进行液相质谱串联法检测。

2 结果 2.1 线性关系确定

线性范围:0.020~20 ng/mL。回归方程为y=4 750 x + 100 (y为峰面积; x为浓度,ng/mL),相关系数r=0.999 3。

2.2 检测限和定量限

以信噪比(S/N)为3:1,测得OTA的检测限为0.01 ng/mL;以信噪比(S/N)为10:1,测得定量限为0.02 ng/mL。

2.3 精密度实验

日内RSD为2.1%~3.3%,日间RSD为2.2%~4.3%,表明该方法具有较好的稳定性。

2.4 方法的回收率

0.2、2、20 ng/mL加样水平的阴性样品的回收率分别为71.0%、83.7%、86.0%,RSD分别为8.0%、9.0%、6.1%。表明该方法具有较高的准确度。

2.5 样品测定

OTA的保留时间为2.3 min,内标丁螺环酮的保留时间为2.1 min,基质中共存的其他物质不干扰OTA以及丁螺环酮的测定。按回归方程计算样品中的OTA含量,在6份样品中检测到OTA,检出率为50.0%,含量为0.03~0.18 ng/mL。

3 讨论

中药成分复杂多样,一味中药往往含有几十甚至上百种不同成分基质复杂。当采用高效液相-荧光检测器检测时,难免会出现干扰峰或者假阳性结果[9, 10]。本研究采用高效液相-串联质谱法,最低检测限为0.01 ng/mL,灵敏度高,可以有效地对药酒中是否存在痕量赭曲霉毒素进行确证并对含量进行定量研究。该方法回收率为71%~86%,重复性好,符合欧盟相关标准[8]。并且基于免疫亲和柱对赭曲霉毒素A吸附的专属性和所建立方法采用多反应监测扫描模式,专属性强,有效地避免了假阳性问题的出现。

欧盟对于OTA在酒(包括发泡酒,不包括烈性酒和酒精浓度> 15%的酒)和水果酒中的最大限量为2 ng/mL[8]。FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)在2004年第44届年会上决定将赭曲霉毒素A每周耐受摄入量(PTWI)由112 ng/kg体重降低到100 ng/kg体重[11]。本实验样品中OTA的平均含量为0.07 ng/mL,假设其为枸杞果酒中OTA污染的平均含量,结合WHO建议成年人每天服用1~2杯酒[12],即大约200 mL,可估算出枸杞果酒OTA的每周平均摄入量为1.4 ng/(kg·bw) (按人均体重60 kg计算),其远低于赭曲霉毒素A每周耐受摄入量100 ng/(kg·bw)的阈值。本研究检测样品的数量较少,中药酒剂中真菌毒素具体污染情况有待于今后进一步研究。

参考文献
[1] 谢妮,徐强,吕相征,等.高效液相色谱法检测小麦、大米中赭曲霉毒素A[J].中国公共卫生,2003,19(2):210-211.
[2] Kabak B.Ochratoxin A in cereal-derived products in Turkey:occurrence and exposure assessment[J].Food and Chemical Toxicology,2009,47(2):348-352.
[3] 匡莹,杨美华.酒类中外源性有害残留物及其检测方法研究进展[J].安徽农业科学,2010,38(18):9854-9856.
[4] 江涛,李凤琴,王环宇,等.赭曲霉毒素A免疫学检测方法的研究[J].中国公共卫生,2004,20(5):556-558.
[5] 李泓.枸杞及其有效成分的药理学研究进展[J].中草药, 1995,26(9):490.
[6] 于雷,王剑锋,刘丽波,等.枸杞抗辐射损伤作用[J].中国公共卫生,2007,23(10):1158-1159.
[7] Yang L,Wang LN,Pan JY,et al.Determination of ochratoxin A in traditional Chinese medicinal plants by HPLC-FLD[J].Food Additives and Contaminants:Part A,2010,27(7):989-997.
[8] The commission of the European Communities.Commission Regulation No 1881/2006 of December 2006 Setting maximum level for certain contaminants in foodstuffs[J].Office Journal of European Union,2006,364:5-18.
[9] 郑荣,毛丹,王柯,等.柱后衍生-高效液相色谱法测定酸枣仁中黄曲霉毒素G2,G1,B2,B1[J].中国卫生检验杂志,2010, 20(1):36-37.
[10] 王元凯,王君,严亚贤.玉米赤霉烯酮检测方法研究进展[J]. 中国公共卫生,2009,25(9):1100-1101.
[11] 李磊,赖心田,张毅杰,等.用免疫学方法调查分析腊肉制品赭曲霉毒素A及其风险评估[J].中国卫生检验杂志,2008,18(8):1605-1606.
[12] Logrieco A,Ferracane R,Visconti A,et al.Natural occurrence of fumonisin B2 in red wine from Italy[J].Food Additives and Contaminants:Part A,2010,27(8):1136-1141.