内毒素(endotoxin，ET)是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)复合物的一部分，由 O特异性多糖、核心多糖、类脂 A构成，类脂 A是生物反应关键部分，具有热稳定性、抗原性和毒性特点^[1] 。常见损害包括致热反应、白细胞数目减少、施瓦兹曼反应、全身炎症反应综合症和内毒素血症等^[2] 。近期研究还表明内毒素在中暑发病中起着不可忽视作用^[3] 。目前，鲎试剂法^[4]是检测内毒素金标准。酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)特异性好、检测限低，能替代鲎试剂，不仅保护稀有动物鲎且能避免样品颜色、浊度干扰。国外内毒素抗体价格昂贵且适用范围窄。本研究直接使用精制内毒素为免疫抗原制备兔多克隆抗体，为进一步内毒素检测提供依据。

Bio-Tek全波长酶标仪 (美国 Bio-Tek公司) ，高速低温离心机(德国 eppendorf公司) ，超净工作台 (苏州净化设备有限公司) 。 2.0 kg健康大耳白兔[同济动物实验中心，SYXK (鄂) 2010-0057]，大肠杆菌精制型内毒素、福氏完全、不完全佐剂 (美国 Sigma公司) ，大肠杆菌 O157∶ H7(武汉市疾病预防控制中心) ，抗内毒素类脂 A (Lipid A)羊多克隆抗体(英国 Abd-Serotec公司) ，内毒素检查用水(内毒素含量 ＜ 0.001 EU /mL) (厦门鲎试剂厂) ，无蛋白封闭液 (美国 Thermo公司) 。

大肠杆菌 O157 ∶ H7接种于营养肉汤中，(140 r /min，37 ℃ ，20 h) ，在山梨醇麦康凯平板活化，再接种于营养琼脂斜面培养基上(37 ℃ ，20 h) 。加入 3 mL无菌生理盐水，37 ℃静置 3 h，将菌液吸出待用。

参考文献 ^{[6, 7]}方法，选用 2只健康家兔，免疫前，兔耳外缘取血 1～2 mL制备血清，作为阴性对照。将大肠杆菌精制内毒素和福氏完全佐剂混合(1:1)并充分乳化后作为免疫原，皮下多点免疫注射 2 mL免疫原，以后每 2周加强免疫注射 2 mL内毒素溶液和弗氏不完全佐剂混合乳液 (1:1) ，前 3次，剂量恒定 (0.5、 0.25 mg /mL) ，后 2次免疫剂量逐次增加，0.75、 1.00 mg /mL和 0.50、 0.75 mg /mL。第 5次免疫后 1周，心脏取血。免疫过程中，每周取血制备血清跟踪效价。

测试 1%牛血清白蛋白 (bovine serun albumin，BSA) 、 1%酪蛋白、原倍无蛋白封闭液、 10%小牛血清和 1%明胶封闭效果。根据封闭效果，选择原倍无蛋白封闭液。

将 10 μg /mL精制内毒素 100 μL加入酶标板，4 ℃过夜;移去包被液，每孔用 300 μL磷酸盐 －吐温缓冲液(phosphate buffer-tween，PBS-T)洗涤液洗 3次，每次 5 min，加入 300 μL无蛋白封闭液，37 ℃湿盒中反应 1 h;洗涤，加入兔血清 100 μL (稀释度为 1∶ 100、 1∶ 200、 1∶ 400直至 1∶ 12 800，同时设空白对照和阴性对照，免疫前正常兔血清为阴性对照，稀释液为空白对照) ，37 ℃湿盒中反应 1 h;洗涤，加入 100 μL辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP)标记的驴抗兔 lgG，37 ℃湿盒孵育 1 h;洗涤，加入 100 μL邻苯二胺显色底物 ，常温避光反应30 min，50 μL H₂SO₄终止反应，酶标仪 A_492nm处测吸光度(^A)值。血清效价阳性判断标准:以吸光度(^A)值(检测孔 －空白孔)与吸光度(^A)值(阴性孔 －空白孔)之差 ≥0.2，之比≥2倍，为检测孔效价阳性。

辛酸 －硫酸铵法^[8]纯化抗体，光密度法测定抗体中蛋白含量，根据公式:蛋白浓度(mg /mL) = 1.45 A_280nm-0.74A_260nm计算溶液中蛋白质浓度。

采用间接酶联免疫吸附试验(indirect competitive ELISA，icELISA) ，酶标板中加入内毒素 100 μL，4 ℃过夜;洗涤，加入 300 μL无蛋白封闭液，37 ℃湿盒中反应 1 h;洗涤，同时加入 50 μL抗内毒素抗体和 50 μL内毒素，37 ℃湿盒中反应 1 h;洗涤，最后，加入 100 μL HRP酶标驴抗兔 lgG，37 ℃湿盒孵育 1 h;洗涤，加入 100 μL邻苯二胺显色底物，常温避光反应 30 min，50 μL H₂SO₄终止反应，酶标仪 A 492nm处测吸光度(^A)值。

使用方阵滴定法测定，将内毒素按照 96孔 ELISA板横向分别稀释成 1、 2.5、 5、 10、 20、 40、 80和 160 μg /mL包被酶标板，每孔 100 μL，4 ℃过夜;无蛋白封闭液封闭后，每孔先加入 50 μL的 PBS，抗体按照 ELISA板纵向稀释成 1∶ 100、 1∶ 250、 1∶ 500、 1∶ 1 000、 1∶ 2 000和 1∶ 4 000，每孔 50 μL，其余程序同上。以吸光度 (^A)值等于 1.0左右且使用抗体量最少为原则，选择包被抗原浓度和抗体稀释倍数。

内毒素兔多克隆抗体、羊多克隆抗体分别与精制型、复合型内毒素反应，按照 icELISA方法检测内毒素兔多克隆抗体、羊多克隆抗体与精制型、复合型内毒素的反应效价。

图 1

图 1 兔血清效价随免疫时间变化

由图 1可知，随着免疫次数增多和剂量加强，血清效价逐渐增高，9周后，2只兔血清效价均可达 1∶ 6 400。纯化后兔抗体效价变为 1∶3 200;蛋白浓度为 1.86 mg /mL。

图 2

图 2 兔多克隆抗体检测大肠杆菌内毒素 icELISA 结果

图 2显示内毒素浓度与吸光度(^A)值成反比例关系，线性回归方程为:y =-0.1 ln(x) + 0.765，内毒素最低检测浓度为 50 ng /mL。

羊多克隆抗体与精制内毒素反应效价仅为1∶ 400 ，反应较弱。兔多克隆抗体、羊多克隆抗体与大肠杆菌 O157∶ H7菌液反应效价分别为 1∶ 16 000与 1∶ 32 000，效价较高。

预实验发现，精制内毒素毒性强，免疫剂量过大容易引起家兔出现全身性感染而死亡。因此，采取了前 3次小剂量免疫、后 2次将免疫剂量逐次增加的方案。本研究结果表明，抗血清效价随着免疫次数增多，兔血清效价逐渐上升，在第 5次免疫 1周后，效价达 1∶ 6 400。抗体效价增长趋势与方宇等^[6]研究一致，且效价高于国内李生等^[7]制备的同种多抗。本研究建立的 icELISA，能检测到最低内毒素浓度为 50 ng /mL，高于国外 Fink等 ^[9]测得的内毒素最低检测限(250 ng /mL) 。

国外多家试剂公司所制备的抗内毒素抗体都是利用菌细胞为免疫原，无法确定能否与精制内毒素反应。本研究使用的抗内毒素羊多克隆抗体(大肠杆菌 O157全细胞提取类脂 A为免疫原)只与大肠杆菌复合型内毒素结合，且与大肠杆菌精制内毒素反应极为微弱。表明内毒素在纯化后，其抗原位点较细菌胞体中原始结合型内毒素少。因此，使用该类抗体用于内毒素检测时，会低估某些复杂环境中内毒素含量。本研究制备的内毒素抗体在检测复合内毒素效价方面较国外产品稍差，但却能与精制内毒素反应，扩大了抗体使用范围，为进一步研究内毒素提供了较好材料。