大豆是人类重要食物资源，大豆异黄酮(soybean isoflavones，ISF)是其主要功能成分之一，具有防治癌症、降低血脂、抗氧化、预防骨质疏松和改善妇女更年期综合症等多种生理功能^[1] 。近年来，ISF抗癌研究成为热点，已证实 ISF对人乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多种细胞有明显抑制作用^{[2, 3, 4]} 。长春瑞滨(vinorelbine，NVB)是一种细胞周期特异性药物，主要通过抑制着丝微管蛋白聚合，使细胞分裂停止于有丝分裂中期，其终末半衰期为 40 h，适用于非小细胞肺癌和乳腺癌患者等，具有血液、神经、胃肠道和呼吸道毒性^[5] 。肿瘤化疗作为全身性治疗手段具有不良反应且毒性较大等问题。因此，探索药物替代或联合应用以期减少用量或能够延缓、逆转其耐药药物，成为目前研究热点。本研究通过观察 NVB和 ISF单用或联合应用时对肺腺癌 A549细胞增殖影响，为二者在临床上联合应用提供参考依据。

A549细胞(中国科学院上海细胞研究所) ，大豆(中国东北产) ，噻唑兰(美国 Sigma公司) ; NVB(江苏豪森药业股份有限公司) ，RPMI 1640培养基(美国 GIBCO公司) ，小牛血清 (北京华美生物工程公司) ，胰蛋白酶(美国 DIFCO公司) 。U-2010紫外分光光度仪(日本岛津公司) ，OLYMPUS倒置显微镜(日本奥林巴斯公司) ，RT-2100酶标仪(深圳雷杜公司) 。

将大豆胚轴用 50%甲醇提取，上 C18层析柱，依次用不同浓度甲醇溶液梯度洗脱，收集大豆异黄酮丙二酰化糖苷，经酸解得大豆异黄酮苷元。通过薄层层析和高效液相色谱法分析产品组成和纯度^[6] 。

肺癌细胞贴壁生长，培养于含 10%小牛血清、100 U /mL青霉素、链霉素的 RPMI 1640培养液(pH 7.2)中，置 37 ℃、相对湿度 90% 、5% CO₂孵箱内培养。取对数生长期 A549细胞按每孔 1 × 10⁵个细胞接种于 96孔板中，每孔体积 200 μL。待细胞贴壁后，ISF组加入 ISF使其终浓度分别为 20、40、80和 160 mg /L，NVB组加入 NVB使其终浓度分别为 2、4、8、16和 32 mg /L，同时设对照组。每孔加药量 20 μL，分别培养 24、48和 72 h。联合组先以 ISF作用 24 h后，再加入 NVB使其终末浓度同单独用药组，继续培养 44 h。2药合用时比例为 1∶ 1，即每种单药剂量浓缩 1倍，各加 10 μL。另设 ISF作用 68 h和 NVB作用 44 h组，计算预估抑制率。每个浓度每个时点均设 6个复孔。于终止前 4 h，每孔加入 5 g /L噻唑兰溶液 20 μL，继续孵育 4 h后弃上清液，加入 150 μL二甲基亚砜，轻轻振荡 10 min，使结晶物完全溶解，于 490 nm波长处测吸光度(A值) ，计算生长抑制率。抑制率(% ) = (对照组 A值 －给药组 A值) /对照组 A值 ×100%。

采用 Weeb系数判定联合用药相互作用，预估抑制率(%) = A + B ― A × B，其中 A、B分别为 ISF、NVB单药作用抑制率。当实际抑制率 ＞预估抑制率时，表明联合用药有协同作用;当实际抑制率 =预估抑制率时，表明联合用药有相加作用;当预估抑制率 ＞实际抑制率 ＞ A和(或) B时，表明联合用药有次加作用。

取对数生长期 A549细胞接种于 96孔细胞培养板中，24 h后换液，加入含 40 mg /L ISF或 /和 3 mg /L NVB的 10%新生小牛血清 RPMI 1640培养液 200 μL，另设不加药物对照组。置 5% CO₂孵箱内培养 24 h。在倒置显微镜下观察细胞生长状态，并收集细胞用 4%戊二醛和 1%锇酸固定、脱水、包埋、切片、染色，观察 ISF及 NVB单独和联合作用后 A549细胞亚结构改变。

数据采用 x ± s表示，应用 SPSS 11.5统计软件进行 t检验和方差分析，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2.1 ISF组成分析大豆胚轴中异黄酮总含量达 3.5% ，含大豆苷元、大豆黄素和染料木黄酮糖苷、丙二酰化糖苷和乙酰化糖苷。薄层层析和高效液相色谱法分析结果表明，未水解提取粉中异黄酮主要形式为丙二酰化糖苷，占异黄酮总量 70% ，糖苷占 17% ，乙酰化糖苷和游离苷元仅为 1%和 11% 。水解产品收率为 28.9% ，纯度为 40.2% ，其中大豆苷元、黄豆苷元和染料木酮之比约为 10∶ 5∶ 3。

表 1

表 1 ISF 及 NVB 对 A549 细胞增殖抑制作用( x ± s，n = 6)

表 1 ISF 及 NVB 对 A549 细胞增殖抑制作用( x ± s，n = 6)

ISF或 NVB干预 A549细胞后，二者对 A549细胞生长均有抑制作用。ISF和 NVB对肿瘤细胞生长抑制呈时间和浓度依赖性，随着时间延长和浓度增加抑制效果更明显(t = 3.2～6.8，P ＜ 0.05) 。

表 2

表 2 ISF 联合 NVB 对 A549 细胞增殖抑制作用( x ± s，n = 6)

表 2 ISF 联合 NVB 对 A549 细胞增殖抑制作用( x ± s，n = 6)

采用 Weeb系数法计算预估抑制率，当 NVB浓度为 2和 4 mg /L时，2药联合对 A549细胞增殖抑制有次加作用，当 NVB浓度为 8、16和 32 mg /L时，2药联合对 A549细胞增殖抑制具有协同作用。

图 1

图 1 A549 细胞透射电镜结构观察( Bar = 2 μm)

透射电镜观察结果显示，对照组细胞完整、核大，细胞表面有丰富微绒毛，可见凝集异染色质，细胞内有较多粗面内质网、线粒体、分泌颗粒。ISF组 A549细胞肿胀、空泡变性; NVB组 A549细胞胞质浓缩，胞体缩小，微绒毛减少，细胞内可见大量线粒体肿胀、嵴断裂和空化变性现象;联合用药组 A549细胞亚结构与 NVB组细胞相似，胞浆及核皱缩，可见细胞内线粒体肿胀和空化现象。

大豆异黄酮研究近年来不断受到重视，尤其在抗癌方面。已有研究证实 ISF可诱导肿瘤细胞周期改变和细胞凋亡，从而抑制多种肿瘤细胞增殖^[7] 。本研究结果显示，在所用浓度范围内 ISF能有效抑制 A549细胞增殖，其细胞生长抑制率随着药物浓度升高和时间延长而增加，具有量效和时效关系。同时，NVB单独或与 ISF联合应用时，随着 NVB浓度增加，对肺腺癌 A549细胞生长抑制效应也增加;当 NVB浓度 ＞ 8 mg /L时，与 ISF联合应用对肺腺癌 A549细胞生长抑制效应明显强于 ISF单独用药，表现有相加或协同作用。提示 ISF与 NVB联合用药时，只需小剂量 NVB就达到抗细胞增殖高效应，可减少高剂量 NVB所致药物不良反应。二者联合应用为肿瘤临床用药开拓了新思路，有望降低化疗药物不良反应。通常，两药呈现协同作用往往是因为二者具有不同作用机制。在与 NVB协同作用中，ISF通过何种机制发挥其主要作用，2种药物给药顺序对肿瘤细胞抑制率的影响还有待于进一步研究。