近十几年来,植物雌激素的生物学作用研究主要集中在大豆异黄酮降血脂、预防癌症和女性骨质疏松方面^{[1, 2]},对木酚素的研究较少。亚麻籽是植物雌激素-木酚素的最佳来源,是一般植物含量的100~800倍^[3]。有研究表明,亚麻籽中的木酚素主要成分被称作开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside,SDG),属于多酚类物质,主要存在于亚麻籽表皮的纤维层中;木酚素进入人体后,在肠道细菌作用下,可分解为哺乳类动物特有的肠二醇(enterodiol,ED)和肠内酯(enterolactone,EL),被机体吸收利用^[4]。另有研究表明,血液中高水平的木酚素与心血管疾病和某些癌症发病危险性的降低具有高度的相关性^[5]。本研究拟建立一种SDG的实验室提取分离和检测方法,为进一步开发和研究SDG的生物活性作用提供科学依据。

(1)受试物:亚麻籽(黑龙江省农业科学院);(2)主要试剂与仪器:SDG标准品,纯度>95%(哈尔滨博润生物科技有限公司);甲醇、无水乙醇、丙酮、磷酸、氢氧化钠、盐酸、氢氧化钙、硫酸(均为分析纯,沈阳试剂二厂)。岛津SPD-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司);电热恒温水浴锅(大连医疗器械厂);旋转蒸发器(上海亚东生化仪器厂);有机溶液过滤器(天津恒奥科技发展有限公司);干燥箱(上海跃进医疗器械厂);超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);索氏提取装置(天津玻璃器材厂)。

将亚麻籽去除杂质后置干燥箱内60℃烘干4h,用粉碎机将其粉碎后过30目分子筛。取适量置于大烧杯中,加入石油醚^[6](液固比:3:1)室温搅拌脱脂2次,每次1h,抽滤后得固体,80℃干燥5h,得亚麻籽脱脂粉。

称取亚麻籽脱脂粉40g,分别用索氏提取器法、加热回流法和超声波提取法^[7]提取SDG。所得固体称重,计算SDG粗提物的固体得率(%)。

参考文献[6],分别选取甲醇、乙醇、丙酮3种溶剂,液固比10:1,根据对SDG的提取效果,确定最佳提取溶剂。再用体积分数为30%、50%、70%、90%的溶剂溶液进行提取分析,确定最佳溶液的体积分数。

利用加热回流提取法,参考文献[8]分别选择提取时间2、4、6、8h,提取溶液为50%丙酮溶液,根据得到的SDG粗提物的量,确定最佳提取时间。

参考文献[9, 10]及预实验结果,选择NaOH-HCl系统和Ca(OH)₂-H₃PO₄系统对SDG粗提物进行碱解,将碱解后的产物过滤后定容,用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定SDG含量,确定碱解方法;确定碱解方法后,分别选择30、60、90、120、180min对粗提物进行碱解,HPLC测定SDG含量,确定最佳碱解时间。

对同一份SDG粗提物溶液,连续6次进样进行HPLC检测,计算测定方法的精密度。称取SDG粗提物100μg,溶于10mL甲醇中。取该溶液1mL(3份)分别加入浓度为4μg/mL的SDG标准应用溶液1mL混合均匀,分别用HPLC检测样品溶液和加标样品溶液SDG峰面积,每次进样10μL,换算浓度,计算加标回收率。

参考文献[11],根据实验室条件及与预实验结果,确定SDG的HPLC色谱检测条件为:色谱软件:N2000浙江大学工作站;色谱柱:COSMOSIL C₁₈ Waters;柱温:25℃;流动相:甲醇-水(70:30);流速:1mL/min;进样量:10μL;检测波长:280nm。

加热回流提取法得到的SDG粗提物固体得率最高,为3.04%;其次为超声波提取法,为2.89%,索氏提取法提取效率最低,为2.37%。故后续实验提取方法均选择加热回流提取法。

当用丙酮进行提取时,SDG粗提物的固体得率最高,为3.86%;其次为乙醇和甲醇,SDG粗提物固体得率分别为3.04%和2.76%,因此确定实验提取溶剂为丙酮。在此基础上发现体积分数为50%的丙酮溶液提取所得的SDG粗提物固体得率最高,为5.33%,其次为70%的丙酮溶液,为5.29%。30%、90%丙酮溶液提取得SDG粗提物固体得率均不高,分别为3.05%和4.08%。提示过高和过低体积分数的溶液均不是SDG溶解的最佳浓度。

在选择的提取时间内,得到的提取物固体重量无明显提高(5.33%~5.70%)。提示在2h内,SDG在极性相似的提取液中(本实验提取溶液为50%丙酮溶液)已能够较好溶出,考虑到长时间提取耗费能源和其他干扰因素的影响,确定实验提取SDG的最佳时间为2h。

HPLC检测的SDG谱图显示,NaOH-HCl系统较Ca(OH)₂-H₃PO₄系统在SDG的提取中更易出现杂质峰,故确定实验碱解系统为Ca(OH)₂-H₃PO₄系统。在进行不同的碱解时间研究中,发现SDG的提取率随碱解时间的增加而增加,在30~60min内碱解速率最快,60min以后碱解速率趋于缓慢,碱解≥90minSDG的碱解释放量基本保持恒定,确定最佳碱解时间为90min。

分别配制浓度为2、4、6、8、10、20、40、60、80、100μg/mL的SDG标准溶液,经检测在该浓度范围内色谱峰面积与SDG浓度成线性,回归方程为Y=5149.5X+7387.4,r=0.999。同时进行的精密度和回收率实验结果显示,6次重复测定的相对标准偏差RSD=5.836%,加标回收率为104.85%。经检测SDG出峰时间为3.390min,提取的SDG粗提物的纯度为32.48%。

中国的研究者通常选用不同浓度的甲醇、乙醇或者异丙醇作为亚麻木酚素的提取溶液^{[6, 7, 8, 10]}。本研究根据实验结果并综合考虑溶剂毒性和生产成本等因素,确定使用丙酮溶液作为亚麻木酚素的提取溶液,其优点为:丙酮的沸点(56.48℃)较甲醇、乙醇低,并且不与水形成共沸混合物,使得在回流提取法中提取温度仅需达到其沸点;丙酮的挥发性较大,容易从提取物和提取液在浓缩过程中去除,并可回收循环使用;丙酮的毒性远小于甲醇;用丙酮提取得到的SDG粗提物固体得率高于用乙醇提取的得率。Charlet等^[11]使用终浓度为0.1mol/L的NaOH溶液碱解3h,使亚麻木酚素从其络合物中释放出来,再用2mol/LHCl、100℃酸解2.5h。该方法繁琐,碱解作用不大,耗费时间长。张文斌等^[12]提出用6mol/LNaOH溶液室温下碱解2h(最终碱浓度为0.25mol/L),再用6mol/L盐酸中和。本研究选择Ca(OH)₂-H₃PO₄溶剂系统对亚麻木酚素提取物进行碱解,结果显示,碱解时间缩短(90min)。同时使用Ca(OH)₂-H₃PO₄碱解系统的优点还在于:Ca(OH)₂与H₃PO₄反应生成微溶于水的CaHPO₄,能够很容易从含有亚麻木酚素水提物中以离心或者抽滤的方式去除,较少影响HPLC检测;用Ca(OH)₂进行碱解可以使亚麻木酚素浓缩液不具有吸湿性,优于用NaOH-HCl进行碱解。