哈蟆油(Oviductus Ranae)是中国雌性林蛙(Rana temporaria chensinensis David)的干燥输卵管。有研究表明，其含有多种生物活性物质，具有补肾益精、养阴润肺、退热消炎等功效和明显的生理保健作用，临床上用于阴虚体弱、神疲乏力、咳嗽咳血等症^[1]。哈蟆油利用酶解技术加工处理后具有良好的溶解性和流动性^[2]。疲劳是是机体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的1种正常生理现象，标志着机体原有工作能力的暂时下降，也可能是机体处于伤病状态的1个先兆^[3]。评价疲劳的实验包括耐力实验和生化指标检测^[4]。本研究采用酶解法^[5]对哈蟆油进行处理，并按卫生部的《保健食品检验与评价技术规范》^[6]对哈蟆油酶解物抗疲劳作用进行功能学评价，为进一步开发利用哈蟆油保健产品提供科学依据。

(1)主要仪器与试剂:722N型分光光度计(上海尤尼柯有限公司);DS-1型组织匀浆器(上海正慧工贸有限公司);HH．S21-8-S型恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂);TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂);LL3000型冷冻干燥机(德国Heto公司);游泳箱(50cm×40cm×35cm)。碱性蛋白酶(美国Sigma公司);二乙酰肟、苯甲酸、蒽酮试剂等均为国产分析纯。哈蟆油(吉林省白山市北亚药业)经长春中医药大学中药鉴定教研室姜大成教授鉴定为中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的干燥输卵管。(2)实验动物:6～8周龄SPF级BALB/C种雄性小鼠240只[吉林大学基础医学院动物实验中心，许可证号:SCXK-(吉)2008-0005]，体重为(20±2)g。(3)哈蟆油酶解物制备:参照文献[5]制备哈蟆油酶解物。Folin-酚法测其蛋白含量为57．4%，硫酸－苯酚法测其糖含量为25.3%。(4)动物分组与处理:小鼠随机分为4大组(60只/组，分别用于负重游泳时间、血清尿素氮、血乳酸、肝糖原测定。每大组又随机分为低、中、高剂量哈蟆油酶解物组(剂量分别为0.15、0.3、0.6g/kg)和空白对照组，每组15只。配制低、中、高剂量受试液时，分别称取0.15、0.3、0.6g哈蟆油酶解物加蒸馏水分别至100mL，每10g体重灌胃1mL，每天1次，连续30d，空白对照组给予等体积的蒸馏水。(5)负重游泳试验:末次给予受试样品30min后置于游泳箱中游泳，水深30cm，水温(25±1)℃，鼠尾根部负荷5%体重铅皮，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。(6)血清尿素氮测定:末次给予受试样品30min后，在30℃水中不负重游泳90min，休息60min后拔眼球采血，于4℃静置3h后，以2000r/min离心15min，取血清用二乙酰－肟法^[6]测定血清尿素氮含量。(7)肝糖原测定:末次给予受试样品30min后，处死小鼠，取肝脏，经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，称取肝脏100mg，采用蒽酮法^[6]进行肝糖原测定。若受试物组肝糖原水平明显高于对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)，可判定该受试物有促进小鼠肝糖原储备的作用。(8)血乳酸测定:末次给予受试样品30min后，从内眦静脉丛采血20μL，然后不负重在30℃的水中游泳10min后停止，分别于游泳后0、20min内眦静脉丛采血20μL，测定血乳酸，计算血乳酸曲线下面积^[6]。(9)统计分析:应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

(1)各组小鼠负重游泳时间与血清尿素氮含量:哈蟆油酶解物各剂量组负重游泳时间均比空白对照组延长，血清尿素氮含量均低于空白对照组，但差异均无统计学意义;表明哈蟆油酶解物对负重游泳时间延长及血清尿素氮含量降低的作用不明显。(2)各组小鼠肝糖原含量:哈蟆油酶解物低剂量组肝糖原含量为(5828.79±176.54)g/100g肝，明显高于空白对照组的(4792.82±193.21)g/100g肝，差异有统计学意义(t=2.39，P＜0.05)，表明哈蟆油酶解物能明显增加小鼠肝糖原储备量。哈蟆油酶解物高剂量组肝糖原含量为(5218.75±175.87)g/100g肝，高于空白对照组，但差异无统计学意义。(3)各组小鼠血乳酸含量与血乳酸曲线下面积(表 1):小鼠游泳前，哈蟆油酶解物各剂量组血乳酸含量均低于空白对照组，差异均有统计学意义(t=2.85、3.54、4.03，P＜0.01);游泳后0min，各剂量组血乳酸含量均低于空白对照组，但差异均无统计学意义;游泳后20min，各剂量组血乳酸含量均低于空白对照组，差异均有统计学意义(t=2.65、2.72、2.45，P＜0.05);各剂量组血乳酸曲线下面积均低于空白对照组，差异均有统计学意义(t=3.06、3.07、3.01，P＜0.01)，表明哈蟆油酶解物具有抑制血乳酸生成或加快血乳酸消除的能力。

表 1

表 1 哈蟆油酶解物对小鼠血乳酸含量的影响( n = 5， x± s)

表 1 哈蟆油酶解物对小鼠血乳酸含量的影响( n = 5，x± s)

本研究结果表明，低剂量哈蟆油酶解物能明显增加小鼠肝糖原含量;哈蟆油酶解物各剂量组在游泳20min后与空白对照组比较，差异均有统计学意义，表明哈蟆油酶解物具有抑制血乳酸生成或加快血乳酸消除的能力;同时可以延长小鼠负重游泳时间并降低血清尿素氮含量，但差异无统计学意义。血清尿素氮浓度可反映体内蛋白质分解的情况，其浓度与机体机能、疲劳程度及负荷量大小呈密切正相关;肝糖原水平能说明疲劳发生的快慢或程度，肌糖原消耗的同时，为维持血糖水平，肝糖原储备减少;血乳酸是肌肉活动的主要代谢产物，血乳酸浓度可反映无氧代谢水平、疲劳的产生和消除速度^{[7, 8]}。哈蟆油经酶解后的多肽具有吸收速度快、耗能低、吸收率高等优势^[9]。本研究结果表明，哈蟆油酶解物有一定的缓解体力疲劳作用。