中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (10): 1283-1286   PDF    
引用本文
温红玲, 郝树彬, 高峰, 赵丽, 袁晓晶, 司鲁莹, 王东旭, 王志玉. 肠道病毒71型山东临沂分离株3D区遗传进化分析[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(10): 1283-1286.
WEN Hong-ling, HAO Shu-bin, GAO Feng, et al. Evolution of 3D region of enterovirus 71 strains isolated in Linyi, Shandong province, China[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(10): 1283-1286.
肠道病毒71型山东临沂分离株3D区遗传进化分析
温红玲1, 郝树彬2, 高峰3, 赵丽1, 袁晓晶1, 司鲁莹1, 王东旭1, 王志玉1     
1. 山东大学公共卫生学院病毒学研究室实验畸形学教育部重点实验室, 山东济南250012;
2. 山东省医疗器械质量监督检验中心;
3. 山东临沂市人民医院
收稿日期: 2011-08-02.
基金项目: 国家自然科学基金(30901265);教育部博士点基金新教师基金(20090131120068);山东省自然科学基金(ZR2010CQ030);山东大学公共卫生学院青年人才创新基金(GGWS200801)
作者简介: 温红玲(1977- ),女,山东人,副教授,博士,研究方向:分子病毒学和传染性疾病流行病学。
通讯作者: 王志玉,E-mail:zhiyu.wang@sdu.edu.cn
摘要: 目的 构建肠道病毒71型(EV71)山东临沂分离株3D区的系统进化树,进行遗传进化分析,探讨3D区与神经毒力的关系。方法 于2009—2010年在山东省临沂市人民医院采集手足口病(HFMD)患儿的粪便标本和咽拭子标本107份,进行EV71的分离;用Bioedit和MEGA 4对EV71山东临沂分离株SDLY1、SDLY11、SDLY48、SDLY96、SDLY107的3D区进行序列分析,参比序列选自GenBank。结果 3D区的系统发生树分析结果显示,5株临沂分离株在发生树上比较集中,SDLY11、96、107的3D区同源性最高,与CoxA16原型株G-10的系统发生关系较近,与EV71原型株BrCr/70的系统发生关系较远;3D区碱基构成比和氨基酸构成比分析显示,含量最高的碱基为A(29%),含量最高的氨基酸为亮氨酸(＞10%);基因序列比对和氨基酸序列比对分析结果显示,碱基突变较多,但大多为静默突变,临沂分离株与CoxA16 G-10之间的氨基酸突变中有很大一部分是赖氨酸与精氨酸之间的突变,在SDLY107的3D区发现了3个特有的氨基酸突变:N37S、K142R、G261E。结论 EV71山东临沂分离株3D区的进化可能与CoxA16 G-10有关,突变N37S、K142R、G261E可能与EV71的神经毒力有关。
关键词: 手足口病(HFMD)     肠道病毒71型(EV71)     3D区     遗传进化分析    
Evolution of 3D region of enterovirus 71 strains isolated in Linyi, Shandong province, China
WEN Hong-ling, HAO Shu-bin, GAO Feng, et al    
Department of Virology, School of Public Health, Shandong University, Ji'nan, Shandong Province 250012, China
Abstract: Objective To establish a phylogenetic tree of enterovirus 71 strains isolated in Linyi,Shandong province based on the changes of 3D region to reveal the relationship between EV71 3D and neurovirulence.Methods Enterovirus 71 strains were isolated from 107 stool and throat swab specimens collected from Linyi People's Hospital.The nucleotide and amino acid sequences of 3D region of the strains SDLY1,SDLY11,SDLY48,SDLY96,and SDLY107 were aligned using Bioedit and MEGA 4.The phylogenetic tree,gene distance,nucleotide composition,amino acid composition,nucleotide sequence alignment,and amino acid sequence alignment were determined.Results Phylogenetic analysis of 3D region showed that the phylogeny was close within Linyi strains,especially within SDLY11,96,107,and the phylogeny was closer between Linyi strains and CoxA16 G-10 than that between Linyi strains and standard strain BrCr/70.Analysis of nucleotide composition and amino acid composition showed that composition of nucleotide A or leucine was the highest.Alignment of nucleotide and amino acid demonstrated some mutations of K and R,and 2 specific mutations for strain SDLY107,E947D and K1873R.Conclusion Evolution of 3D region of enterovirus 71 strains isolated in Linyi may be relevant to CoxA16 G-10,and two mutations of N37S and K142R may be related to the neurovirulence of EV71.
Key words: hand,foot and mouth disease     enterovirus 71     3D     evolution analysis    

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员,是手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一,易并发中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染,严重威胁婴幼儿的健康。研究发现,脊髓灰质炎病毒3D区的突变导致小鼠体内病毒生长速率、RNA积累、温度耐受及毒力的变化,因此有研究推测3D区可能与病毒毒力和生物特性的变化有关[1]。本研究对EV71山东临沂分离株的3D区进行了序列分析和遗传进化分析,探讨其与病毒致病性的关系。

1 材料与方法 1.1 材料

于2009-2010年在山东省临沂市人民医院采集HFMD患儿的粪便标本和咽拭子标本107份,进行EV71的分离。所有患儿均出现发热和手、足、口部位的皮疹。患儿年龄为0~5岁,平均年龄为1.9岁。分离病毒用细胞为人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cells,RD),由山东省疾病预防控制中心陶泽新医师惠赠。SDLY107分离自1例HFMD合并脑炎的死亡患儿,SDLY96分离自1例HFMD合并脑炎的重症患儿,其余分离自单纯HFMD患儿。

1.2 方法 1.2.1 主要试剂

病毒RNA提取使用RNA提取试剂盒(美国Omega公司),RT-PCR使用一步法RT-PCR试剂盒(德国QIAGEN公司)。

1.2.2 EV71的分离和鉴定

收获的RD培养物上清液用WHO推荐的肠道病毒通用引物和EV71的鉴定引物进行初步鉴定[2]。

1.2.3 全基因组测序

将提取的EV71的基因组进行RT-PCR扩增,完成全基因组测序[2]。

1.2.4 序列分析和进化分析

将EV71山东临沂分离株的3D区基因序列与其余参比序列(包括EV71和CoxA16)利用Bioedit和MEGA4绘制系统发生树,进行遗传进化和系统发生分析。根据系统发生分析的结果,选取与EV71山东临沂分离株位于同一分支和不同分支的代表毒株进行基因距离分析,分析EV71山东临沂分离株和参比序列的基因序列和氨基酸序列,探讨3D区与EV71毒力之间的关系。分析中所用的参比序列来自GenBank,主要选取中国大陆其他地区的EV71代表株(深圳株、北京株等)以及研究较多的毒株BrCr/70、MS/87和Nagoya株及CoxA16的部分毒株。

2 结果 2.1 系统发生树分析(图 1)
图 1 EV71山东临沂分离株的3D区系统发生树分析

系统发生树中包括27株EV71的3D序列和10株CoxA16的3D序列。结果显示,5株临沂分离株在发生树上比较集中,SDLY11、96、107的3D区同源性最高。EV71山东临沂分离株的3D区与CoxA16原型株G-10、阜阳株FY18的系统发生关系较近,位于同一进化枝上的还有中国大陆的其他分离株,包括EV71的深圳株(SHZH98、SHZH03、SHZH08)、河南株、北京株、西安株、兰州株、重庆株。与BrCr/70、MS/87和Nagoya株等中国大陆以外地区的EV71分离株和其他CoxA16分离株(包括昆明株、深圳株、广州株、厦门株)的系统发生关系较远,这些毒株位于另外一个进化枝上,与G-10、FY18较远。

2.2 基因距离分析

3D区的基因距离分析显示,山东临沂分离株3D区与Lanzhou01、BJ08、HENAN/DC/2010、1/SHENZHEN/08/China/HFMD/2008、SZ/HK08-5、SHZH03的基因距离较近(＜0.1),与其余EV71毒株的基因距离较远,与CoxA16原型株G-10的基因距离(0.17)较与EV71原型株BrCr/70的距离(0.28)近。

2.3 碱基构成比分析和氨基酸构成比分析

3D区碱基构成比分析显示,A含量最高,约占29%;其次为T,约占26%;C含量最低,约占22%;G约占23%。3D区氨基酸构成比分析显示,平均含量最高的是亮氨酸(>10%),平均含量最低的是色氨酸和半胱氨酸(1.5%)。

2.4 基因序列比对分析和氨基酸序列比对分析

选择同属于C4亚型的进化关系较近的河南株HENAN/DC/2010(分离自死亡患儿)、深圳株1/SHENZHEN/08/China/HFMD/2008和4/SHENZHEN/08/China/HFMD/2008(分离自HFMD患儿)与本研究的山东临沂株共8株EV71的3D区进行基因序列和氨基酸序列比对分析。结果显示,碱基突变较多,但大多为静默突变,临忻分离株与CoxA16G-10之间的氨基酸突变中有很大一部分是赖氨酸与精氨酸之间的突变。5株HFMD表型分离株中有4株的第114位核苷酸为G,而CNS表型分离株均为A(G114A),第504和1380位核苷酸(T504C和G1380A)也发生了类似的突变;5株HFMD表型分离株中有3株分离株的第782位核苷酸为G,而CNS表型分离株均为A(G782A),第906和1080位核苷酸(C906T和G1080A)也发生了类似的突变。同时,在SDLY107的3D区发现了与其他所有毒株均不同的11个特有的突变:C24T、C66T、A110G、T330C、A425G、T522C、A624G、C627T、T888C、T1173C、C1344T。氨基酸序列分析显示,上述17个位点中14个为同义突变,有3个位点(N37S、K142R、G261E)观察到了氨基酸突变。

3 讨论

EV71感染婴幼儿主要表现为单纯的HFMD,预后良好,少数病例可并发严重的脑炎,甚至死亡,目前关于EV71导致中枢神经系统感染的研究较多,但尚未阐明其机制。近年来,EV71在亚太地区流行[3, 4, 5],是HFMD患儿死亡的主要原因,而青海省西宁市的一项血清流行病学调查显示,1~6岁儿童的EV71抗体阳性率较低,大部分儿童对该病毒易感[6],因此EV71对婴幼儿的健康威胁较大。EV71作为一种RNA病毒,在进化过程中易发生突变。有研究表明,肠道病毒间还存在血清型间的同源重组现象[7]。Haung等[8]研究发现EV71的2B和3C区存在重组位点,提示非结构基因可能会通过基因重组形成新的毒株甚至基因型。这些研究结果为病毒的遗传多样性和毒力的变化提供了可能。Arita等[9]利用反向遗传技术的研究发现,3D和3'UTR区域对EV71的毒力有影响。Chang等[10]在分析不同临床表现型的EV71分离株时,发现3D蛋白的V263I突变可能与病毒毒力有关。Kung等[11]研究发现,3D蛋白的第251位氨基酸T可能与EV71的神经毒性强弱有关。这些研究表明,3D区存在毒力决定簇的可能性比较大。本研究通过氨基酸序列分析发现,近半数的氨基酸变化是K与R之间的突变。这种突变的倾向在病毒的遗传进化和毒力中是否有意义尚不明确。N37S、K142R、G261E突变仅在SDLY107中出现,在其余毒株中保守,与病毒毒力的关系需要利用反向遗传学技术进行进一步研究。

EV71基因组的3D区编码病毒复制所需的依赖RNA的RNA聚合酶,在进化过程中较保守,常作为进化途径分析的标志之一[12]。本研究结果表明,目前山东临沂EV71流行株的3D区可能已经与CoxA16的3D区发生了重组,重组的主要毒株来源可能为CoxA16 G-10株和FY18株。Chan等[13]对EV713D区进行遗传进化分析,结果提示EV71的3D区可能会与CoxA16 G-10进行基因重组。张慧娟等[12]对EV71北京分离株3D区进行了遗传进化分析,研究结果显示EV71北京分离株3D区与CoxA16G-10同源性较高,亲缘关系比较密切,提示该区可能存在EV71与CoxA16 G-10的重组位点。这种重组与病毒的致病性和流行程度之间是否有关系尚需进一步深入研究。

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