2012, Vol. 28
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染多发生于< 5岁幼儿,已成为目前全球范围内取代脊髓灰质炎的最重要的中枢神经毒性病原,严重威胁婴幼儿的健康。近年来,EV71在亚太地区的流行呈逐年上升趋势,特别是EV71更易导致中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染,是手足口病患儿死亡的主要原因,已引起广泛的关注。因此有关EV71导致中枢神经系统感染的研究对手足口病的预防、治疗具有重要意义。本研究就近几年EV71致中枢神经系统感染研究进展加以综述。
1 EV71感染导致中枢神经系统病变概述研究表明,不同时期和地区的EV71的流行中,其主要症状不尽相同。其神经毒性于1975年保加利亚大流行时开始引起重视[1]。1975年保加利亚流行的EV71感染主要侵犯中枢神经系统,引起麻痹症状,致死率高达29.5%,罕见皮肤疱疹[2]; 1998年中国台湾地区流行的EV71感染既有皮肤疱疹也有中枢神经系统症状,有> 12万的人被感染,死亡78例,主要死因为中枢神经系统并发症。Huang[3]对该次流行中44例CNS感染者进行了分析,根据神经系统受累的程度将脑干脑炎分为3级:Ⅰ级表现为肌震颤和共济失调,5%的儿童留下永久性神经系统后遗症; Ⅱ级表现为肌震颤和颅神经受累,导致20%的儿童留下后遗症; Ⅲ级表现为心肺功能迅速衰竭,80%的儿童死亡,存活者均留下不同程度的后遗症。近年来,EV71在中国的流行中,也有部分患儿表现出中枢神经系统感染的症状[4]。目前报道显示,患儿大多有发热症状,单纯手足口表型者发热持续时间较短,体温较易控制,而CNS表型及有合并症者病情较重,发热时间长且控制困难[5]。
EV71感染后的死亡病例尸检的病理检查显示,脑组织水肿,脑干及脊髓炎症最为明显,脑及脊髓内小血管内皮细胞变性、坏死、血栓形成,血管周围可见单核淋巴细胞呈套袖样浸润,无病毒包涵体。超微结构显示脑干及脊髓神经细胞变性,空泡化及线粒体内膜性小泡形成,部分神经元内见微小RNA病毒颗粒[6]。Wei等[7]对2例EV71感染并发脑干脑炎的死亡患儿进行尸检,结果显示,大脑和脑干有非常严重的炎症和坏死,肺部有水肿和出血。心肌和其他器官未见炎细胞浸润。
2 EV71感染导致中枢神经系统病变机制 2.1 细胞病变有研究认为,EV71感染后所引发的细胞病变效应的原因是其蛋白酶裂解细胞真核翻译起始因子-4G造成细胞蛋白合成迅速下降为零,细胞蛋白翻译关闭[6]。Chen等[8]研究表明,EV71感染后,激活细胞内的Abl-Cdk5信号通路触发了神经细胞的凋亡,但Ab1被激活的机制尚在研究中。而有关EV71进入宿主细胞的过程目前所知甚少,这很可能与抗病毒靶点有着密切关系。
2.2 病毒受体病毒与受体的结合是引发宿主受病毒感染的主要决定因素。对于病毒受体的研究将有助于更好的理解病毒的致病机制。目前有关EV71受体的研究已经取得了部分进展。Koike[9]和Yamayoshi等[10]通过转染人类基因组DNA使小鼠细胞系获得了EV71的易感性,该研究结果显示,清道夫受体B2(SCARB2)是EV71感染的受体。EV71能够结合可溶性SCARB2或者细胞表面表达的SCARB2,SCARB2抗体可以抑制这种结合,表达人类SCARB2可使得原本对EV71不敏感的细胞支持EV71的繁殖并出现细胞病变,EV71对细胞的感染性可被抗SCARB2抗体阻断;同时研究中还显示,SCARB2还支持CoxA16对细胞的感染。Yang等[11]研究结果显示,唾液酸O-联多糖或糖脂的消耗可以明显减少EV71对DLD-1肠细胞的感染,而N-联多糖则未观察到相似的作用。用唾液酸酶预处理DLD-1肠细胞,可使EV71的复制显著降低20倍,结果表明,DLD-1肠细胞上的唾液酸O-联多糖或糖脂是EV71感染的受体,而人乳中天然的唾液酸多糖可保护DLD-1肠细胞免受EV71感染。Nishimura等[12, 13]和Miyamura等[14]研究结果显示,P-选择素配基-1 (PSGL-1)是EV71进入白细胞的受体;继而对PSGL-1的一系列研究结果显示,VP2蛋白149位aa的突变可使EV71在L-PSGL-1细胞上获得更高的复制效率; PSGL-1的N-端酪氨酸的硫酸化可能更易于EV71在白细胞的穿入和复制。
除病毒受体外,EV71还可能通过其他途径进入细胞。Mohamed等[15]研究结果显示,网格蛋白介导的内吞作用是EV71进入宿主细胞的途径,这为EV71的致病机制的研究和抗病毒策略的发展提供了基础。
2.3 毒力决定簇从分子生物学的角度来讲,EV71为单股正链RNA病毒,病毒复制所依赖的聚合酶缺乏校读功能,在基因组复制中有较高的突变率。因此,在EV71的感染和流行过程中,随着病毒的复制,很可能发生关键氨基酸的变异,从而导致其毒力的改变。此外,在同一流行中有不同基因型病毒感染的情况,为病毒的基因重组提供了可能,基因重组可以导致不同病毒株间直接的基因信息转移,目前已发现多次流行过程中的主要流行株为重组株[16, 17, 18]。这些都有利于病毒快速调整以利于感染宿主。决定EV71神经毒性的可能是神经毒力决定子,可能是单一的位点作用,也可能是多个位点的共同作用,在这个过程中,环境、宿主因子以及感染病毒的数量也发挥了不可忽视的作用。需要提供更多的证据来阐明神经毒力株与高病死率之间的关系。但Shih等[19]的研究并未找到类似的毒力决定簇。McMinn等[20]在分析表型手足口病分离株和具神经毒性分离株时,在VP1上发现了一个重要的氨基酸变化Ala 170 Val,分析可能是由于VP1的170位氨基酸是高度保守的,当其发生变化后,导致VP1空间结构发生改变,从而改变了病毒与受体的结合能力,而使其毒力发生根本的改变。该研究提示,可从分析表型与序列间的关系入手来寻找毒力决定簇的候选基因。近年来在毒力决定簇方面的研究也取得了一些进展,初步筛选出了几个可能与中枢神经毒力有关的位点。Sunita等[21]对2000年新加坡手足口病的暴发中分离的致死株EV71(Singapore fatal,SF)和非致死株EV71(non-fatal,NF)进行了全序列分析,结果显示,大多数氨基酸的突变为静默突变,只有3A区的1 506位残基在标准株和NF株中为丙氨酸,在SF株中为苏氨酸。
Wang等[22]将1株EV71在小鼠中连续传代后,产生一株毒力增强的MP 4株,细胞培养表现出更大的空斑,生长更快,感染1日龄小鼠和7日龄小鼠都表现出更强的毒性,核苷酸序列分析表明,5'UTR上有4个核苷酸突变,VP2区有3个核苷酸突变,2C区有8个核苷酸突变,分别导致VP2区1个aa突变和2C区的4个aa突变。
Chang等[23]分析了6株EV71不同临床表现型的分离株的序列,6株分离株均为C4基因型,序列分析显示,核苷酸的变化主要位于5'UTR内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),氨基酸的变化主要位于非结构蛋白,该研究结果显示,强毒株(Ah1、Hn1、Hn2)和弱毒株(Cq1、Cq2、Cq3)之间一个非常重要的氨基酸变化Val(1994) lle,位于3D(病毒RNA依赖的RNA聚合酶)的指环区域。2日龄的BALB/c分别通过脑内和腹腔接种6株病毒,所有接种Ah1、Hn1、Hn2的小鼠均出现后肢瘫痪,随后死亡,所有接种Cq1,Cq2和Cq3的小鼠在21 d的实验期间均成功存活。研究结果表明,不同的临床表现型的EV71分离株具有不同的典型序列,接种小鼠后会导致不同的病死率。
Kung等[24]分析了1986和1998年暴发中的EV71分离株的3D聚合酶序列,发现了T251V和T251I突变,在EV71的复制子系统中引入I251T突变,在35℃不会影响荧光素酶活性,在39.5℃时荧光素酶活性降低,该突变不仅降低了EV71在39.5℃的体外复制,而且降低了小鼠适应株MP4在新生鼠模型上的毒力,结果表明,251位的苏氨酸突变产生了EV71的温度敏感表型,这可能有助于毒株循环中的减毒。
2.4 反向遗传学技术在EV71中枢神经系统感染研究中,一个很关键的问题就是要获得具有完整感染性的cDNA克隆,进而获得突变后的病毒。感染性克隆技术提供了一个最直接的方法,从分子水平鉴定病毒毒力位点,使感染性克隆成为一个非常敏感的工具。目前口蹄疫病毒、猪瘟病毒丙型肝炎病毒、登革热病毒、新城疫病毒、流感病毒等都成功构建了感染性分子克隆,并在病毒的毒力和疫苗的研制等方面进行了进一步研究[25]。Arita等[26]通过分段扩增拼接的方法成功构建了名古屋株的感染性cDNA克隆,并将脊髓灰质炎疫苗株(PV1)的减毒决定簇引入其中; Arita等[27]又在此基础上将145位的甘氨酸突变为谷氨酸,使该突变株成功的感染了3~4周龄NOD/SCID鼠,突破了EV71仅对4日龄以内小鼠敏感的限制,并分析了PV1减毒决定子对EV71在NOD/SCID鼠模型中的影响,结果显示,在4周龄的NOD/SCID鼠中,3D多聚酶端和3'UTR端的温度敏感决定子对减毒影响较大,而且明显的减毒需要所有决定子共同作用。该研究所采用的反向遗传学技术为今后的研究提供了经验。
2.5 宿主因素除了病毒本身的因素外,宿主本身的免疫状态和细胞微环境的变化可能也影响了宿主对病毒的敏感性。Xie等[28]为研究手足口病伴随中枢神经系统感染的病人的免疫表型,将21例手足口病并发脑炎的病例和14例单纯的手足口病病例纳入研究,结果显示,在感染急性期,重症病例血浆中的B细胞和IgG水平显著升高,NK细胞和T细胞相应减少;恢复期的B细胞和IgG水平快速回复到正常水平,同时伴随着EV71特异性的中和抗体水平增加,研究表明,B细胞和IgG水平的增加可能与EV71感染导致的神经系统的表现有关。Ho等[29]使用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺陷的纤维母细胞作为模型,实验结果显示,细胞的氧化还原状态影响了EV71对细胞的感染性和感染的结局。与正常对照相比,G-6-PD缺陷的细胞支持EV71更有效的复制,出现的细胞病变更明显,细胞生存能力下降。该研究表明,G-6-PD的状态对EV71的感染非常重要。该研究小组又利用Vero细胞为模型研究了天然化合物抑制EV71复制的能力,表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)和没食子儿茶素没食子酸酯(gallo catechin gallate,GCG)有效的抑制了EV71的复制,EGCG和GCG使具有感染性的子代病毒的滴度降低了95%。定量RT-PCR分析结果显示,EGCG抑制了基因组RNA的复制,伴随着明显的细胞保护效应。EGCG和GCG使得EV71感染细胞的生存能力提高了5倍。对病毒的抑制效应与多酚的抗氧化能力具有很好的相关性。该研究表明EGCG可以通过调整细胞的氧化还原状态抑制EV71的复制[30]。因此,对EV71中枢神经系统致病性的研究要综合考虑病毒、宿主和环境的作用。
3 结语综上所述,EV71的基因组中可能存在多个位点与其中枢神经系统的致病机制有关,而且多位点间存在相互作用,加之复杂的宿主和环境的因素,阐明EV71的中枢神经系统致病机制还需要做很多的工作,在今后的研究中,应重点进行以下方面的研究:(1)继续分离不同地区、不同临床表现型的病毒株,分析其全基因组序列,丰富EV71的病毒库; (2)对现有的毒株序列进行全基因组和分区段的分子流行病学研究,结合病毒的流行情况和进化情况,分析病毒的进化和重组在疾病流行中的作用; (3)进行比较基因组学和蛋白组学研究,筛选可能存在的毒力位点,将筛选出的位点进行反向遗传学研究,验证这些位点在EV71致病中的作用; (4)研究病毒与宿主的相互作用,寻找病毒受体,为抗病毒治疗提供靶点; (5)研究宿主的免疫状态(如NK细胞、免疫相关蛋白)与病毒感染的关系; (6)病毒毒力的验证很大程度上依赖于动物模型,因此要加强动物模型的研究,以期获得更加敏感和实用的动物模型。
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