中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (9): 1236-1239   PDF    
引用本文
顾文珍, 董红军, 倪红霞, 张姝, 易波, 杨天池, 谢蕾, 许国章. 宁波市肠道病毒71型分离株全基因序列对比分析[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(9): 1236-1239.
GU Wen-zhen, DONG Hong-jun, NI Hong-xia, et al. Sequence analysis of enterovirus 71 strains isolated from patients with different clinical symptoms in Ningbo city[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(9): 1236-1239.
宁波市肠道病毒71型分离株全基因序列对比分析
顾文珍, 董红军, 倪红霞, 张姝, 易波, 杨天池, 谢蕾, 许国章     
宁波市疾病预防控制中心病毒研究所, 浙江 315010
收稿日期: 2011-03-07.
基金项目: 浙江省卫生厅医药卫生科学研究基金资助项目(2009A190);宁波市科技局资助项目(2009C5008)
作者简介: 顾文珍(1982- ),女,湖北黄冈人,主管医师,硕士,主要从事肠道病毒的分子生物学研究.
通讯作者: 许国章,E-mail:xugz@nbcdc.org.cn
摘要: 目的 探讨浙江宁波地区2010年分离的肠道病毒71型(EV71)中神经毒性相关位点。方法 采集宁波地区2010年手足口病不同症状患者粪便标本,进行荧光聚合酶链反应检测,阳性标本病毒分离;分8个片段对EV71全基因序列和VP1区进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、克隆、测序、拼接、同源性比较,用DNAstar推导其内含子编码的氨基酸序列并比对分析。结果 6株分离株基因全长均为7 406 bp,核苷酸同源性为97.9%～99.4%,其中3株死亡病例标本内部核糖体进入位点(IRES)中的124、272及408位,碱基分别为T、G、A,区别于其他3株手足口轻症患者分离株的A、A和G;3株死亡病例标本位于主要衣壳蛋白VP1区的第715位氨基酸和3C蛋白酶的第1 704位及1 706位的氨基酸分别为甲硫氨酸(met)、精氨酸(arg)及异亮氨酸(ile),区别于3株轻症病例的亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)及缬氨酸(val)。结论 宁波地区2010年分离的EV71 IRES、VP1与3C位点变异与EV71神经毒性相关。
关键词: 肠道病毒71(EV71)型     全基因序列     同源性    
Sequence analysis of enterovirus 71 strains isolated from patients with different clinical symptoms in Ningbo city
GU Wen-zhen, DONG Hong-jun, NI Hong-xia, et al    
Institute of Virology, Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Ningbo, Zhejiang Province 315010, China
Abstract: Objective To determine the neurovirulence-related sites of enterovirus 71 (EV71) isolated in Ningbo area in 2010.Methods Fluorescent PCR was used to detect the excrements of patients with different clinical symptoms.EV71 was isolated and checked from the positive species,and the genome determined with reverse transcription-PCR (RT-PCR) was cloned,spliced,and sequenced with eight superimposed fragments.The homology was analyzed and the amino acid sequences were deduced and analyzed with DNAstar.Results All of the sequences of six strains were 7 406 bp in length and the homology of nucleotide were 97.9%-99.4%.The nucleotide sequence of the three severe cases at the position of 124th,272th and 408th were T,G,and A,respectively,distinguishing from the other three of A,A,and G.According to the deduced amino acid sequences,the three severe cases in the position of 715th,1704th and 1706th were met,arg and ile,respectively,distinguishing from the other three of leu,lys,and val.Conclusion The variations in IRES,VP1,and 3C may be associated with the neurovirulence of EV71 isolated from patients in Ningbo area in 2010.
Key words: EV71     genome     homology    

肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)、肠道病毒属(enterovirus),且EV71和柯萨奇病毒A16(CA16)是引起儿童手足口病最常见的病原体,但与CA16不同的是,EV71急性感染还容易引起无菌性脑膜炎、脑炎、脑干脑炎等神经系统疾病,自1999-2009年,EV71在中国北京、深圳、浙江等地区引起的神经系统症状,导致30多例患儿死亡[1, 2]。因此,为了有效的预防控制EV71的感染,对EV71致病的分子机制研究尤为重要[3]。目前,国内外学者通过测序和点突变等各种方法对EV71致病的分子机制进行了研究,研究表明,EV71引起神经系统症状最可能的位点在VP1、3C、3D及5'非转译区(5'non-translated region)[4]。为了解浙江宁波市EV71流行株的生物学特征及其与神经毒性的关系,本研究选取宁波市2010年EV71和柯萨奇病毒A组16型(CA16)分离株,进行了同源性分析和序列对比。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)分离毒株:9株,分离自2010年宁波市妇女儿童医院手足口病患儿粪便标本,其中EV71核酸阳性的死于神经系统症状手足口病病例粪便标本3株(编号分别为Ningbo/01/2010~Ningbo/03/2010),EV71核酸阳性的轻症病例粪便标本3株(编号分别为Ningbo/04/2010~Ningbo/06/2010),柯萨奇病毒A组16型(CA16)核酸阳性的手足口病患儿粪便标本3株(编号分别为NBCA16-01-2010~NBCA16-03-2010)。(2)参考株与细胞:参考株基因序列从Genebank中下载,其中U22521-A和U22522-B2引起神经系统症状,其他参考株均引起一般手足口症状。RD、Vero细胞(中国疾病预防控制中心国家脊灰实验室提供)。(3)试剂与仪器:RNeasyMiniKit试剂盒(德国Qiagen公司),EV、CA16和EV71核酸检测试剂盒(上海之江公司),One-step RNA PCR Kit(AMV)、凝胶回收试剂盒、载体pMD18-T、5-FULL PACE kit、3-FULL PACE Core Set Ver 2.0试剂盒(日本TaKaRa公司)。

1.2 方法 1.2.1 病毒核酸提取

按照RNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取病毒核酸RNA;采用EV、CA16和EV71核酸检测试剂盒,荧光聚合酶链反应检测病毒核酸RNA。

1.2.2 病毒分离与鉴定

病毒分离按照世界卫生组织(WHO)《脊髓灰质炎实验室操作手册》第4版[5]中肠道病毒分离操作规程进行:将核酸检测阳性的标本接种于RD和Vero细胞,置于含5%CO2,36.5℃的培养箱中培养,每天观察细胞病变(CPE),当CPE达到+++至++++时收获,连续传3代,采用荧光聚合酶链反应及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行鉴定。

1.2.3 引物

(1)扩增EV71全基因采用的8对引物(F1~F8):F1:F:CTCCCCCAGTGTAGATCAGG,位点298~317;R:TCTCCCACAATTTAGTGTCCA,位点1145~1166;目的片段大小868bp。F2:F:ATAGTCGGCTATGGTGAGTG,位点1044~1065;R:AGTGAGTGTTGCTGATCCATGGT,位点2219~2241;目的片段大小1198bp。F3:F:TGTTCACTGGGTCCTTTATGGC,位点3013~3034;R:ACCAGCATAATTTGGGTTGGCT,位点3260~3281;目的片段大小1211bp。F4:F:TACCATTCATGTCACCTGCGA,位点3013~3033;R:CTAGATACGACACATTCCCAAA,位点4303~4326;目的片段大小1314bp。F5:F:GTCGGCATAGTGTCTACTGGTG,位点3689~3710;R:GTTTTCAGAGCACAGTTTAGCGG,位点4875~4897;目的片段大小1210bp。F6:F:TGTCAAATGGTATCCACCGTAG,位点4646~4667;R:GTCTTCCAGTTTCTTTATTGGGCTT,位点5954~5978;目的片段大小1333bp。F7:F:ATCGCTTAGCAGTCCTCCCA,位点5481~5500;R:TTCATTCTACTCACGTCCCT,位点6341~6360;目的片段大小880bp。F8:F:CGGTACTGAGAATCTTGAGGCTA,位点6241~6263;R:CATAATTTGGGATAGCCAACG,位点7269~7289;目的片段大小1049bp。2~4对引物和扩增条件参照文献[6],其他几对引物根据参考株列FY23-K14(GU459071.1)、BJ08(FJ828519.1)、Anhui1-09(GQ994988.1)、FY23-K12(GU459070.1)的保守区域设计。(2)EV71VP1:F:GCAGCCCAGAAGAACTTCAC,位点2370~2389;R:ACCACTCTAAAGTTGCCCAC,位点3266~3385;目的片段大小1015bp。(3)CA16VPl:F:CCGCTCAGGACAACTTTTA,位点2376~2392;R:CCA-GTCATTGTGCGTGGC,位点3404~3421;目的片段大小1046bp。EV71VP1引物由浙江省疾病预防控制中心馈赠,CA16VP1引物序列和扩增条件根据参考文献[7],所有引物均由上海赛百盛公司合成。

1.2.4 核苷酸序列扩增与测序

采用RT-PCR扩增EV71全基因8个重叠片段序列及EV71和CA16的VP1序列;分别采用试剂盒5-FULL PACE kit和3-FULL PACE Core Set Ver 2.0扩增EV71全基因序列5'末端和3'末端。扩增后的目的片段采用凝胶回收试剂盒纯化后,插入载体pMD18-T中,转化至大肠埃希菌DH5a,蓝白斑筛选阳性克隆。阳性克隆由大连宝生物生物技术有限公司进行核苷酸序列测定。

1.2.5 序列分析与对比

采用DNAMAN软件进行拼接和同源性对比,采用DNAstar的MegAlign软件对编码区进行氨基酸推导和对比分析。

2 结果 2.1 全基因组核苷酸序列对比(图 1)
图 1 6株分离株全基因序列同源性比对的结果

EV71分离株全基因序列8个首尾重叠的克隆片段经过拼接后,结果显示,6株的基因全长均为7406个核苷酸(nt),基因组结构符合肠道病毒结构特征,5-NTR为742nt,3-NTR为84nt,整个基因组仅1个开放阅读框,位于5-NTR和3-NTR之间,为6582nt,编码1个含2194个氨基酸的多聚蛋白。6株分离株全基因组核苷酸的同源性为97.9%~99.4%,其中5-NTR碱基变化较大,6株序列同源性为97.6%~99.3%,3株死亡病例标本组中134、272及408位碱基分别为T、G、A,3株轻症病例分离株为A、A、G。

2.2 编码区氨基酸序列对比(图 2)
图 2 多聚蛋白部分氨基酸序列比对

6株分离株编码区均编码2194个氨基酸,有31个位点的氨基酸存在变异,其中VP4区有6个,VP2区有1个,VP3区有2个,VP1区有1个,2A区有3个,2B区有1个,2C区有2个,3B区有3个,3C区有4个,3D区有8个,3C及3D蛋白酶中氨基酸的变异率明显高于其他区域。3株死亡病例分离株VP1区的第715位氨基酸为甲硫氨酸(met)区别于轻症病例组和CA16参考株的亮氨酸(leu);而3C区第1704位氨基酸为精氨酸(arg)区别于轻症病例组和参考株的赖氨酸(lys);而1706位点3株死亡标本组和4株参考株为异亮氨酸(ile),而轻症病例组和其他2株参考株为缬氨酸(val),3D蛋白酶有8个氨基酸不同,但未明确的位点可以区分死亡病例株和轻症病例株。

2.3 EV71 VP1核酸序列对比(图 3)
图 3 EV71及CA16分离株VP1区域部分氨基酸序列对比

根据VP1序列比对结果,6株EV71分离株均为C4亚型,与中国大陆近几年流行趋势一致[8]。3株死亡病例分离株的EV71VP1区核苷酸序列完全相同,3株轻症病例分离株同源性也较高,核苷酸同源性为98.1%~99.0%,由于密码子的简并性,DNAstar推导的3株轻症病例分离株氨基酸序列也完全相同;与死亡病例分离株比较,仅150位点的氨基酸有差异,死亡病例分离株为为蛋氨酸(met),轻症病例组、CA16原型株、参考株及宁波市3株CA16分离株均为亮氨酸(leu)。

3 讨论

研究结果显示,宁波市2010年手足口病患者分离株中,3CD区的氨基酸变异率比其他区域明显高,3CD蛋白质和5-NTR四叶草结构结合以帮助病毒的复制,明显增强其神经毒性,3D蛋白是依赖RNA的RNA聚合酶,催化碱基之间的互补配对,对病毒的大量繁殖起着至关重要的作用。Weng等[9]研究发现3C蛋白酶不仅能裂解许多宿主细胞转录和翻译的重要蛋白,还能进入宿主细胞核抑制宿主的3-pre-mRNA的转录以及多聚腺苷的合成,从而抑制宿主细胞的功能,促进病毒RNA的表达和蛋白的合成,与EV71的致病性密切相关。宁波地区这3例死亡标本分离株中3C及3D蛋白酶的变化可能与其引起的神经毒性相关。

肠道病毒基因组5-NTR区IRES通过形成二级结构来调节肠道病毒多聚蛋白的翻译,从而影响肠道病毒的复制能力和毒力,野生型脊髓灰质炎病毒的IRES序列中仅1个碱基的变化足以改变该病毒的毒力[10, 11]。脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗sabinⅠ型和Ⅲ型中IRES序列单个碱基的替换对毒力的改变起着关键性作用;IRES替换实验表明,将弱毒的人鼻病毒的IRES重组到野生型的脊髓灰质炎病毒的基因组中,产生的重组病毒毒力大大下降。但是IRES与EV71的神经毒性关系是否和脊髓灰质炎病毒那样有明确的位点,本研究中的3个位点变化是否可以作为宁波地区2010年强毒力株和弱毒力株的区分部分标志,还需扩大标本量,进行碱基替换实验以及动物实验等进一步研究来证实。

VP1片段一直被作为肠道病毒分型和神经毒性相关的研究对象,有研究认为EV71C1毒株的VP1蛋白170位氨基酸突变(A→V)和5-NTR与聚合酶编码基因的突变是引起其毒力降低的原因[12, 13, 14]。本研究中,3株轻症病例分离株VP1和测序的3株CA16分离株以及Genebank中下载的CA16参考株中150位氨基酸序列相同,均为亮氨酸,区别于3株死亡病例分离株的蛋氨酸;在2010年宁波地区的手足口病流行期间,第150位氨基酸的变化影响EV71与宿主细胞的结合可能与EV71的神经毒力增加相关。

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