结核病的早期快速诊断已经成为制约结核病控制的关键因素^{[1, 2]}。酶联免疫斑点试验(enzymelinked immunosorbent spot assay,ELISPOT)技术是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术,是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一。其原理是根据酶联免疫吸附试验建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学技术,它可以通过检测外周血中分泌结核分枝杆菌抗原特异的IFN-γ的T淋巴细胞数,进行结核分枝杆菌潜伏感染检测和结核病辅助诊断^{[3, 4, 5, 6]}。但进口试剂盒价格昂贵,国内应用报道不多。为此,本研究采用国内研制的一种以CFPl0/ESAT6融合蛋白为刺激剂的检测结核分枝杆菌特异的IFN-γ的ELISPOT试剂盒^{[5, 7]},观察结核病患者和健康人外周血中IFN-γ的T淋巴细胞阳性率,并与抗结核抗体检测法及结核菌素试验(tuberculin pure protein derivative,PPD)进行了灵敏度、特异度对比。现将结果报告如下。

选取沈阳市胸科医院确诊初治结核患者63例作为病例组,其中男性37例,女性26例;年龄17~88岁,平均年龄(51.7±21.3)岁;肺结核53例,肺结核合并胸膜炎7例,结核性胸膜炎3例。选取该院健康体检者39人作为对照组,其中男性23人,女性16人,年龄20~53岁,平均年龄(36.5±16.3)岁。病例组和对照组的性别、年龄及平均年龄差异均无统计学意义。

FS-SPOT结核检测试剂盒(上海铭源数康生物芯片有限公司);人淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物工程医学研究所灏洋生物);细胞培养液RPMI Medium 1640和无血清培养液AIM-V(美国invitrogen/GIBCO公司);结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(天津中新科炬生物制药有限公司);卡介苗纯蛋白衍生物(PPD,成都生物制品研究所);二氧化碳培养箱(北京北方利辉试验仪器设备有限公司),酶联斑点分析仪(Immunospot TATC Analyzer,美国CTL公司)。阳性对照品主要成分为植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)、血清白蛋白和抑菌剂;特异性刺激抗原为结核特异重组抗原、血清白蛋白和抑菌剂。

采用FS-SPOT结核检测试剂盒检测分泌INF-γ的T细胞,严格按说明书操作。用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,调节细胞浓度至2.5×10⁶/L;每个测试样本设微孔板3孔,即阴性对照孔、阳性对照孔和样品检测孔,各孔分别加入50μL完全细胞培养液、50μL阳性对照品及50μL重组的CFP10/ESAT6融合蛋白。此后,各孔均加入100μL含有2.5×10⁵个外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的细胞悬液。37℃、5%CO₂培养箱中孵育20h,弃培养上清,加入200μL4℃预冷的无菌蒸馏水裂解细胞10min后,各孔均加入100μL生物素标记抗体(1:200稀释),37℃孵育1h后,各孔均加入100μL链亲合素-碱性磷酸酶(1:200稀释),37℃孵育30min后各孔均加入显色液100μL,37℃闭光显色7~15min后,可见板底显示紫兰色斑点,加入双蒸水或去离子水终止反应,37℃烘箱中干燥30min。使用酶联斑点分析仪或放大镜计数着色斑点,每1个点代表 1个分泌γ干扰素的T淋巴细胞。阴性对照孔点数＜13,检测孔点数减去阴性对照孔点数≥13,可判断所测标本为阳性;阴性对照孔点数≥13,检测孔点数为阴性对照孔2倍,可判断所测标本为阳性。

常规采集外周静脉血4~5mL,3000r/min离心15min,检测卡平衡至室温,在硝酸纤维素膜(nitrocellulosefiltermembrane,NC膜)区中间位置加入4μL血清,待样本完全吸收后,在加样孔中加入50~80μL稀释液,15min观察结果,出现1条红色质控线为阴性,出现质控线和反应线2条红线为阳性。

吸取卡介苗PPD(50U/mL)0.1mL(5U),采用曼图氏法注射于前臂掌侧皮内。于注射后72h检查注射部位反应,并记录卡痕。若硬结的横径及纵径的平均数≥5mm为阳性。

采用SPSS 17.0统计软件分析,计数资料以率表示,进行χ²检验校正法分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

应用ELISPOT、抗结核抗体方法及PPD皮肤试验检测了63例结核病患者和39名健康者,63例结核病患者阳性例数分别为58、47和45例,其灵敏度分别为92.1%、74.6%和71.4%;39名健康者中阳性例数分别为5、9和13例,其特异度分别为87.2%、76.9%和66.7%。结核病组ELISPOT与抗结核抗体方法检测均为阳性者46例,均为阴性者4例,ELISPOT阳性而抗结核抗体阴性者12例,ELISPOT阴性而抗结核抗体阳性者1例;ELISPOT与PPD方法均为阳性者44例,均为阴性者4例,ELISPOT阳性而PPD阴性者14例,ELISPOT阴性而PPD阳性者1例。正常对照组ELISPOT与抗结核抗体方法均为阳性者2例,均为阴性者27例,ELISPOT阳性而抗结核抗体阴性者3例,ELISPOT阴性而抗结核抗体阳性者7例;ELISPOT与PPD均为阳性者1例,均为阴性者22例,ELISPOT阳性而PPD阴性者4例,ELISPOT阴性而PPD阳性者12例。ELISPOT检测方法其灵敏度明显高于抗结核抗体和PPD法,差异均有统计学意义(χ²=5.702,P＜0.05;χ²=4.568,P＜0.05)。ELISPOT检测方法特异度与抗结核抗体方法及PPD皮肤试验检测结果比较,差异均无统计学意义。ELISPOT代表性结果见图 1。

图 1

注:A:阳性结果，其中a为阴性对照孔(斑点数0个)，b为阳性对照孔(斑点数140个)，c为检测孔(斑点数73个)，检测孔斑点数－空白 对照孔斑点数＞13个;B:阴性结果，其中a为阴性对照孔(斑点数9个)，b为阳性对照孔(斑点数269个)，c为检测孔(斑点数11个)，检测孔 斑点数－空白对照孔斑点数＜13个。 图 1 ELISPOT检测代表性结果

ELISPOT是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术,是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一。Lee等^[8]和Kang等^[9]认为ELISPOT试验敏感度高于PPD试验。本实验结核病组人群PPD皮试结果的阳性率明显低于ELISPOT阳性率,与此观点一致,其原因可能是PPD皮肤试验结果会受人体免疫功能的影响,当机体免疫功能低下时,PPD皮肤试验敏感度会降低^[10]。结核分枝杆菌复合群基因RD1区域编码的ESAT-6和CFP-10是结核特异性抗原,可以诱导较强的细胞免疫反应^[11]。同时,本实验结果显示,应用ELISPOT方法检测,尽管无统计学上的差异,但其特异度仍高于PPD皮肤试验。可能与PPD皮肤试验结果受卡介苗疫苗接种和其他非结核分枝杆菌的感染所影响。ELISPOT方法采用的结核分枝杆菌特异性抗原为ESAT-6和CFP-10,其编码基因RD1是卡介苗和绝大多数非结核分枝杆菌所缺失的基因^[12],因此避免了PPD皮肤试验这一弊端。

本研究应用的国产ELISPOT试剂盒除了继承传统ELISPOT检测方法灵敏度和特异度较高的特点以外,主要应用基因手段合成ESAT-6和CFP-10融合蛋白,解决了一系列多肽合成等造成的检测成本过高的问题。其本身操作简便易行,第2d可得到结果,便于临床规范化操作,为临床结核病诊断提供了一种经济、简洁及快速的方法,适合基层诊所、医院等部门的使用和普及。