中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (9): 1205-1206   PDF    
引用本文
李宁, 宋莲军, 张平安, 王雯, 张楠, 李文杰. 铅暴露对仔鼠海马中β淀粉样蛋白40表达影响[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(9): 1205-1206.
LI Ning, SONG Lian-jun, ZHANG Ping-an, et al. Expression and significance of Aβ40 in hippocampus of offspring with maternal lead exposure[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(9): 1205-1206.
铅暴露对仔鼠海马中β淀粉样蛋白40表达影响
李宁1, 宋莲军1, 张平安1, 王雯2, 张楠2, 李文杰2     
1. 河南农业大学食品科学技术学院, 河南 郑州 450002;
2. 郑州大学公共卫生学院
收稿日期: 2011-08-02.
作者简介: 李宁(1981- ),女,河南西平人,讲师,博士,研究方向:食品质量与安全.
通讯作者: 李文杰,E-mail: lwj@zzu.edu.cn
摘要: 目的 探讨母体铅染毒对子一代小鼠海马组织中β-淀粉样蛋白40(Aβ40)表达影响。方法 雌性小鼠自妊娠第1 d开始经饮水染铅(0.3、1.0、3.0 g/L,对照组饮蒸馏水)至仔鼠出生后21 d,随机抽取各组21日龄仔鼠,分别测其血液和海马组织中铅含量,并采用western blot方法测定海马组织中Aβ40表达水平。结果 孕哺期不同剂量铅暴露21 d后,仔鼠血铅、海马铅水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);western blot结果显示,中、高剂量铅暴露组仔鼠海马组织中Aβ40表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);相关分析显示,Aβ40蛋白表达与血铅、海马铅呈明显正相关(r=0.524、0.613,P=0.001)。结论 母体铅暴露使铅在仔鼠体内蓄积,增强了仔鼠海马组织中Aβ40聚集。
关键词: 铅     神经毒性     蛋白质印迹     β-淀粉样蛋白40(Aβ40)    
Expression and significance of Aβ40 in hippocampus of offspring with maternal lead exposure
LI Ning, SONG Lian-jun, ZHANG Ping-an, et al    
Food Science Technology College of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan Province 450001, China
Abstract: Objective To explore the effects of maternal lead exposure on the expression of amyloid-peptide(beta) 40(Aβ40) in hippocampus of offspring in mice.Methods Female mice were exposed to lead acetate in drinking water at dosages of 0 g/L,0.3 g/L,1.0 g/L and 3.0 g/L from the beginning of gestation to the postnatal days 21 (PND21).Twenty-one days after the birth,the lead contents in blood and hippocampus of the offspring were determined and the expression of Aβ 40 in hippocampus of all the offspring in various dosages groups were determined with western blot.Results The lead contents in blood and hippocampus of various lead exposed groups were significantly higher than that of the control group(P< 0.05).The results of western blot showed that the expression of Aβ40 in hippocampus of moderate and high lead exposure group pups was higher than that of the control group(P< 0.05).The correlation analyses showed that the expression of Aβ40 was positively related to lead content in blood and hippocampus (r=0.524,0.613,P< 0.05).Conclusion Maternal lead exposure may induce the accumulation of lead in the offspring and maternal lead exposure enhances the aggregation of Aβ40 in hippocampus of the offpring mice.
Key words: lead     neurotoxicity     western blot     Aβ40    

铅是一种多媒介污染物，人类可以通过吸入空 气、粉尘和摄取食物、饮用水等暴露于铅环境中〔1〕。 β-淀粉样蛋白40 (amyloid β-protein 40，Aβ40 ) 是 由β 淀粉样蛋白前体(amyloid β-protein precursor， APP) 序列断裂形成的。Aβ40 是Aβ 多肽的可溶性 形式，早发阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 显示出Aβ40 的增加，这可能与APP 的变化有关〔2〕。 可溶性二聚体Aβ40 是最小的突触毒性物质，可以有 效削弱突触结构和功能，是引起AD 的重要物质。 尽管大量研究已经显示当血液中的铅浓度过高时， 铅会在脑内聚集，但能否引起脑内Aβ40 聚集，损伤 神经系统功能，目前还不清楚。本研究采用western blot 法探讨不同水平铅暴露对仔鼠海马组织中Aβ40 表达影响，并分析其与血铅和海马铅之间关系，进一 步探讨铅神经毒性机制。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

三水合醋酸铅[Pb(CH3OO) 2· 3H2O，洛阳市化学试剂厂]; 单克隆抗体羊抗小鼠 Aβ40 ，辣根过氧化物酶鼠抗人IgG (美国Santacruz 公司) ; 二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB) 显色 试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司) ; 过氧化物 酶标记的链酶卵白素(st-reptavidin /peroxidase，SP) 试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司) ; 蛋白 Marker(北京天根生化科技有限公司) 。Z-5000 石 墨炉原子吸收光谱仪(日本日立公司) ; TECAN SUNRISE 酶标仪(瑞士TECAN 公司) ; 170-3940 半干电泳转膜仪(美国Bio-Rad 公司) ; Labscan 扫 描控制和分析前处理软件(美国Amersham Biosciences 公司) ; Biosens 数码成像系统(上海山富科学 仪器有限公司) 。

1.2 方法 1.2.1 动物分组与处理

昆明种雌性小鼠40 只， 雄性小鼠20 只(河南省动物实验中心) ，动物合格 证号: SCXK(豫) 2005-0001，每天18:00 以2:1 雌 雄合笼，次日8:00 检查阴栓，不确定者作阴道涂片， 发现精子为受孕第0 d。将孕鼠随机分为4 组，每组 10 只，分笼饲养。暴露组自怀孕1 d 至仔鼠出生 21 d 分别给予0.3、1.0 和3.0 g / L 醋酸铅饮用水， 对照组饮不含铅蒸馏水。每窝取1 只，每组10 只仔 鼠进行实验，于出生后第21 d 解剖仔鼠取出全脑， 分离海马置液氮中，转存到- 80 ℃冰箱中备用。

1.2.2 仔鼠血铅和海马组织铅浓度测定

血液及 海马组织，经消化后，用Z-5 000 石墨炉原子吸收 光谱仪测定铅含量。

1.2.3 Aβ40 蛋白的western blot 检测

全蛋白提取试 剂盒提取总蛋白，冰上放置1 h，4 ℃离心(12 000 g， 20 min) ; 收集上清液。利用Bradford 法定量总蛋 白，采用十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶 电泳。取蛋白样品各30 μg，经上样缓冲液处理后 上样，其中分离胶12%，电压60 V; 浓缩胶5%，电 压90 V。硝酸纤维素膜10 V 转膜38 min，将膜放 入0.5% Tween-20 的磷酸盐缓冲液(PBST) 中，冲 洗3 次; 封入50 g /L 脱脂奶中，室温缓慢摇动2 h; 加入一抗稀释液(Aβ40 1:200，β-actin 1:500) ，4 ℃ 过夜; PBST 洗膜3 次; 加入辣根过氧化物酶鼠抗人 IgG(1:1 000) 后，室温孵育2 h; PBST 洗膜3 次; 化 学发光法显色; 曝光; 用成像系统扫描蛋白条带后，对 western blot 结果进行半定量分析。采用bandscan V5.0 凝胶分析软件对Aβ40 和β-actin 的灰度值进行 分析，以Aβ40 /β-actin 作为Aβ40 的相对表达量。

1.3 统计分析

所有实验数据用SPSS 12.0 统计 软件进行统计处理，采用单因素方差分析进行多样 本均数比较; 采用Pearson 法分析Aβ40 表达与铅含 量关系，检验水准α = 0.05。

2 结 果 2.1 仔鼠血液和海马组织中铅浓度变化(表 1)
表 1 孕哺期铅暴露仔鼠血液和海马组织中铅 含量(μg /L，x±s，n = 10)

铅暴露组仔鼠血铅和海马铅水平均明显高于对照组 (F = 54.139、9.392，P ＜ 0.05) 。

2.2 各组仔鼠脑海马组织Aβ40 蛋白表达水平变化 (图 1)
注: C: 对照组; L: 醋酸铅0.3 g/L 组; M: 醋酸铅1. 0 g /L 组; H: 醋酸铅3.0 g/L 组。 图 1 各组仔鼠海马组织中Aβ40 的表达

各组仔鼠之间海马组织Aβ40 表达，差异有 统计学意义(F = 84.201，P ＜ 0.05) 。中、高剂量铅 暴露组海马组织中Aβ40 表达明显高于对照组，差异 有统计学意义(F = 53.247、96.318，P ＜ 0.05) ，但是 低剂量组与对照组比较，差异无统计学意义(F = 13.216，P＞ 0.05) 。

2.3 Aβ40 表达与组织铅含量关系

Aβ40 蛋白表达 与血铅(r = 0.524，P = 0.001) 、海马铅(r = 0.613， P = 0.001) 呈明显正相关。

3 讨 论

健康人体内有Aβ 的清除机制，Aβ 的产生与清 除处于一种动态平衡状态。神经元Aβ 清除缺陷出 现在AD 病人的散发形式中(约占所有AD 病例的 90%) ，Aβ 的产生和清除失衡，使越来越多Aβ 聚 集，并在神经元内形成老年斑〔3〕。研究表明，铅暴 露是促使AD 发病的一种危险因素〔4〕。APP mRNA 表达水平上调与早期铅暴露同时发生，APP mRNA 表达，并不是由于储存在骨骼里的铅，在老龄时渗 出，刺激了APP mRNA 表达上调，而是因为发育期 铅暴露。研究表明，APP mRNA 表达的改变伴随着 APP 和它的淀粉样蛋白Aβ 分解产物升高，证实了 APP mRNA 的潜在表达是一个程序性事件，是由早 期铅暴露发动的〔5〕。本研究结果显示与对照组比 较，Aβ40 蛋白在中、高剂量染铅组仔鼠海马组织中的 表达水平明显增高，并且Aβ40 表达与血铅和海马铅 呈明显正相关，提示母体孕哺期铅暴露可引起仔鼠 海马组织中Aβ40 聚集，进而可能干扰正常的海马神 经元功能，造成神经系统损伤。

参考文献
〔1〕 李宁,余增丽,郑艳涛,等.铅对仔鼠学习记忆及海马中CTGF表达影响[J]. 中国公共卫生,2009,25(10):1174-1176.
〔2〕 Krishnaswamy S,Verdile G,Groth D,et al.The structure and function of Alzheimer's gamma secretase enzyme complex [J].Crit Rev Clin Lab Sci,2009,46(5-6):282-301.
〔3〕 Munoz DG,Feldman H.Causes of Alzheimer's disease[J]. CMAJ,2000,162(1):65-72 .
〔4〕 Zawia NH,Basha MR.Environmental risk factors and the developmental basis for Alzheimer's disease[J].Rev Neurosci,2005,16(4):325-337 .
〔5〕 Zawia NH,Lahiri DK,Cardozo-Pelaez F.Epigenetics,oxidative stress,and Alzheimer disease [J].Free Radic Biol Med,2009,46(9):1241-1249.