砷是广泛存在于环境中的类金属元素，饮水砷 暴露可引起人群多器官系统疾病，严重时可引起肿 瘤。据报道，水砷浓度与砷暴露人群皮肤癌、肺癌、 膀胱癌等肿瘤的发生呈显著正相关^{〔1, 2〕}。砷致肿瘤 发生的机制十分复杂，目前尚不十分清楚。有研究 表明，砷暴露可能通过诱导细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS) 水平增高，进而改变细胞周期 进展从而引起肿瘤发生^〔3〕。本研究通过观察亚砷 酸钠(NaAsO₂ ) 作用于人皮肤角质形成细胞 (HaCaT) 后对细胞增殖、细胞周期及ROS 生成水平 的影响，为探讨砷致肿瘤发生的机制提供实验依据。

NaAsO₂ ，纯度≥ 99.0% (美国Fluka 公司) ; DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛 血清(美国Hyclone 公司) ; Alamar Blue、二氯荧光 素(DCFH-DA) (美国Sigma 公司) ; 细胞周期检测 试剂盒(上海碧云天公司) 。SW-CJ-1FD 超净工作 台(日本AirTech 公司) ; Hera cell 150、CO₂ 恒温培 养箱(荷兰Heraeus 公司) ; Multiskan Ascent 354 全 自动酶标仪(芬兰Labsystems 公司) ; FACSCalibur 流式细胞仪(美国BD 公司) 。

HaCaT 细胞株(中科院上海细胞 库) 常规培养于DMEM 培养基(10% 胎牛血清， 100 U /mL青、链霉素) ，在5% CO₂、37℃ 条件下培 养，待细胞进入对数生长期后以胰蛋白酶消化，接种 于96 孔板及6 孔板。

将HaCaT 细胞以1 × 10⁵ 个/mL 密度接种于96 孔板，待细胞进入对数生长期 后，将细胞暴露于不同浓度NaAsO₂ (0、25、 50 μmol /L) 6 h，每个浓度设5 个复孔。待染毒终 点，弃去培养液。每孔加入含10% Alamar Blue 培 养液200 μL。无细胞的6 个对照孔分为2 组，每组 3 孔。分别是Alamar Blue + 培养基对照组和单纯 培养基对照组。37℃、5% CO₂ 培养箱中继续孵育 4 h 后，以酶标仪分别于540 和620 nm 测定吸光度 (A) 值，并计算细胞增殖水平。最终实验结果以各 染毒组增殖水平与对照组增殖水平的相对比值 表示。

将HaCaT 细胞以1 ×10⁵ 个/mL 密度接种于6 孔板，待细胞进入对数生长期后，将细胞 暴露于不同浓度NaAsO₂ (0、25、50 μmol /L) 6 h，每个 浓度设3 个复孔。待染毒终点，弃去培养液，以磷酸 盐缓冲液(phosphate buffered sodium，PBS) 洗细胞 后，用胰蛋白酶消化并制成单细胞悬液。依据试剂 盒操作步骤，以70% 冷乙醇将细胞隔夜固定后，用 碘化丙啶染色，以流式细胞仪在488 nm 波长处进行 检测。

细胞处理及染毒同细胞周期 测定。待细胞培养至染毒终点时，弃去原培养液，以 PBS 冲洗1 次后，加入终浓度为20 μmol /L 的 DCFH-DA，放入培养箱避光孵育30 min 后弃去孵 育液，用PBS 洗2 遍，以0.25%的胰蛋白酶消化、收 集细胞，离心(1 000 r /min，3 min) ，弃上清，加入 PBS 100 μL，将细胞制成单细胞悬液，立即用流式 细胞仪检测荧光强度(激发波长488 nm，发射波长 525 nm) ，并以cell quest 软件对结果进行定量分析。

采用SPSS 13.0 统计软件，以单因 素方差分析对细胞增殖水平、ROS 含量及细胞周期 进行统计学分析，组间比较采用SNK 法，以P ＜ 0.05 表示差异有统计学意义。

表 1

表 1 NaAsO2 对HaCaT 细胞增殖及ROS 水平影响( %， x±s)

表 1 NaAsO2 对HaCaT 细胞增殖及ROS 水平影响( %， x±s)

NaAsO₂ 作用6 h 后，25、50 μmol /L NaAsO₂ 组细胞增殖水平明显低于对照组(F = 92.24，P ＜ 0.05 ) ; ROS 水平则明显高于对照组 (F = 53.87，P ＜ 0.05) 。

表 2

表 2 NaAsO2 对HaCaT 细胞周期影响( %， x±s，n = 3)

表 2 NaAsO2 对HaCaT 细胞周期影响( %， x±s，n = 3)

NaAsO₂ 作用6 h 后，与对照组比较，25、50 μmol /L NaAsO₂ 组细胞G0 /G1 期及S 期细胞数无明显变化 (P ＞ 0.05 ) ，G2 /M 期细胞数则明显高于对照组 (F = 23.03，P ＜ 0.05) 。

砷广泛存在于自然界中，慢性环境砷暴露可导 致人体多器官系统损伤，目前，据报道全世界受到环 境饮水砷暴露的人口达2 亿，中国饮水砷暴露人口 约为300 万^{〔4, 5〕}。由环境砷暴露而引起的慢性砷中 毒已经成为世界范围内一个严重的公共卫生问题。

在细胞周期中，G2 /M 期细胞数比例增高可能 由两种情况造成。一种可能是，细胞在某种处理因 素的刺激下，处于分裂旺盛状态，从而引起分裂期的 4 倍体细胞数增多; 另一种可能是，细胞在外界因素 作用下，发生了DNA 损伤等改变，细胞损伤激活了 细胞周期的调控点，使得细胞处于调控检查状态中， 从而导致细胞停滞在相应阶段，因此也可表现为 G2 /M 期细胞数比例增高^〔6〕。本研究结果显示，2 5、 50 μmol /L NaAsO₂ 组细胞的G2 /M 期细胞数明显 高于对照组，但细胞增殖试验则表明，25、50 μmol /L NaAsO₂ 组细胞的增殖水平明显低于对照组，同时， 染砷组ROS 水平明显高于对照组。提示在本试验 条件下，砷暴露的HaCaT 细胞中，G2 /M 期细胞数比 例增高不是砷暴露引起的促细胞增殖作用所致，而 是发生了G2 /M 期阻滞，引起G2 /M 期阻滞的原因 可能与细胞内高水平的ROS 诱导DNA 损伤从而激 活细胞周期调控点有关，但其具体机制仍有待进一 步研究。