中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (9): 1197-1199   PDF    
引用本文
陈世敏, 王启栋, 吴建英, 胡成进, 刘贤锡. UbcH10基因沉默对裸鼠移植性大肠癌抑制作用[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(9): 1197-1199.
CHEN Shi-min, WANG Qi-dong, WU Jian-ying, et al. Inhibitory effect of UbcH10 gene silencing on colorectal cancer cell xenografts[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(9): 1197-1199.
UbcH10基因沉默对裸鼠移植性大肠癌抑制作用
陈世敏1, 王启栋2, 吴建英1, 胡成进1, 刘贤锡3    
1. 济南军区总医院实验诊断科, 山东 济南 250031;
2. 武警后勤部疾病预防控制中心;
3. 山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所
收稿日期: 2011-04-25.
基金项目: 山东省科技发展计划项目(2008GG30002030)
作者简介: 陈世敏(1971- ),女,山东烟台人,主管技师,博士,主要从事肿瘤分子生物学研究.
摘要: 目的 通过短发夹RNA(shRNA)干扰沉默UbcH10基因的表达,并观察其对裸鼠移植结直肠癌的抑制作用。方法 构建RNA干扰表达载体pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-RNAi(pUbcH10-RNAi),建立UbcH10基因沉默细胞系HT-29/UbcH10-RNAi;采用蛋白印迹法(western blot)评价pUbcH10-RNAi对UbcH10基因表达的影响,观察移植结直肠癌裸鼠的肿瘤生长情况。结果 HT-29/UbcH10-RNAi细胞中UbcH10基因表达明显下调;与对照组比较HT-29/UbcH10-RNAi组肿瘤生长明显减慢,在接种肿瘤细胞12 d后隐约可见瘤体,36 d后断颈处死剥离瘤体重量仅是对照组肿瘤的40%左右。结论 短发夹RNA(shRNA)沉默UbcH10基因对裸鼠移植性大肠癌有抑制作用,提示抑制UbcH10基因表达可能是大肠癌治疗的潜在方法。
关键词: 大肠癌     泛素结合酶UbcH10     短发夹RNA(shRNA)     裸鼠移植瘤    
Inhibitory effect of UbcH10 gene silencing on colorectal cancer cell xenografts
CHEN Shi-min, WANG Qi-dong, WU Jian-ying, et al    
Department of Clinical Laboratory, General Hospital of Ji'nan Military Region, Ji'nan, Shandong Province 250031, China
Abstract: Objective To silence ubiquitin conjugating enzyme-10 (UbcH10) gene by RNA interference(RNAi) and to observe its inhibitory effect on colorectal cancer cell xenograft in nude mouse.Methods The expression vector pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-RNAi (pUbcH10-RNAi) was constructed and the UbcH10 gene silencing cell lines HT-29/UbcH10-RNAi was established.Western blot analysis was used to evaluate the expression of the UbcH10 gene.The inhibitory effect of pUbcH10-RNAi was evaluated in a nude mouse colorectal cancer cell xenograft model.Results The results demonstrated that UbcH10 gene expression was significantly decreased in pUbcH10-RNAi treated cells.HT-29/UbcH10-RNAi cells xenograft demonstrated grow th suppression compared to that of the control.The size and weight of tumors in HT-29/UbcH10-RNAi groups were significantly decreased.On the 36th day after the inoculation,the average weight of tumors in HT-29/UbcH10-RNAi group was only about 40% of that in HT-29/RNAi-NC group and HT-29/PBS group(P< 0.05).Conclusion Silencing of UbcH10 gene by shRNA has antitumor activity on nude mouse colorectal cancer cell xenograft model and may be a therapeutic potential for the treatment of colorectal cancer.
Key words: colorectal cancer(CRC)     UbcH10     shRNAi     nude mouse xenograft    

大肠癌( colorectal cancer，CRC) 包括直肠癌和结肠癌，是常见的恶性肿瘤之一，全世界范围内大肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第3 位[1]。中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会公布的最新数据表明，大肠癌在我国目前总人群的发病率为20 /10 万，发病率占常见肿瘤的第4 位，2008 年上海市大肠癌的发病率占恶性肿瘤的第2 位[2]。目前治疗大肠癌首选手术以及术后常规化疗，手术后5 年生存率＜ 40%[3]。化疗和放疗的联合应用取得一定疗效，但不令人满意。所以探求一种新的治疗方法尤为重要。泛素结合酶UbcH10 ( ubiquitin-conjugating enzymes，UbcH10) 属于泛素结合酶E2 家族的成员，是第10 个被识别的人泛素结合酶，参与泛素介导的蛋白质降解过程[4]。同时，UbcH10 也是参与细胞周期调控的关键因子之一，通过与细胞后期促进复合物APC 相互作用影响有丝分裂纺锤体装配检测点驱动细胞周期的进展[5]。早期研究报道了 UbcH10 基因在大肠癌肿瘤组织的表达明显高于癌旁正常组织，而且与肿瘤的分化程度有关[6]。本研究采用shRNA 沉默UbcH10 基因的表达，观察其对裸鼠移植大肠癌的抑制作用，为大肠癌治疗的方法学研究提供理论依据。

1 资料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 主要试剂

RPMI 1640 培养基和优质胎牛血清( 美国Hyclone 公司) ，转染试剂LipofectamineTM 2000( 美国Invitrogen 公司) ，UbcH10 抗体( 中国台湾 Abnova 公司) ，β-actin 及二抗( 美国Santa Cruz 公司) ，电化学发光试剂盒( 美国Millipore 公司) 。

1.1.2 实验动物

5 周龄BALB /c-nu 裸鼠15 只 [上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号 SCXK( 沪) 2007-0005]，无特定病原体条件下饲养。

1.1.3 细胞株

人大肠癌细胞株HT-29 购自中科院上海细胞所。

1.2 实验方法 1.2.1 shRNA 表达载体的构建

针对UbcH10 编码区的特异性RNA 干扰序列: 5'-AACCTGCAAGAAACCTACTCA-3'; 阴性对照序列为: 5'-AACTAACACTAGCTCAAGACC-3'。针对UbcH10 基因的shRNA 表达载体pGPU6 /GFP /Neo / UbcH10-RNAi( pUbcH10-RNAi) 及其阴性对照表达载体pGPU6 /GFP /Neo /UbcH10-NC( pRNAi-NC) 的构建由上海吉玛制药技术有限公司完成，表达载体包含绿色荧光蛋白标记。

1.2.2 细胞培养及沉默细胞系的建立

HT-29 细胞用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基，在 37 ℃、5% CO2 饱和湿度条件下传代培养，选用对数生长期细胞进行实验。转染前24 h 胰酶消化处于对数生长期的细胞以5.0 × 104 /mL 的浓度接种培养板，次日细胞融合率达到80% 左右时进行转染。实验操作按转染试剂LipofectamineTM 2000 的说明进行，实验用转染试剂LipofectamineTM 2000 与表达载体的重量比为2.5: 1，转染48 h 后加G418 进行筛选维持。

1.2.3 蛋白印迹法( western blot ) 检测细胞 UbcH10 蛋白表达

裂解细胞取40 μg 蛋白进行 12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后转印蛋白至硝酸纤维素膜( NC 膜) ，转膜电流175 mA，30 min。封膜后加入UbcH10 抗体( 1: 800 稀释) 和 β-actin 抗体( 1: 5 000 稀释) 4 ℃过夜，反应结束后用磷酸盐缓冲液洗3 次，每次5 ～ 10 min。然后加入脱脂奶粉配制的二抗( 1: 10 000 稀释) 室温孵育2 h，再次洗膜3 次，每次5 ～ 10 min。最后加入电化学发光光敏剂A 液和B 液，将硝酸纤维素膜X 光胶片暗盒曝光，显影，定影。

1.2.4 体内抑瘤实验

裸鼠15 只随机分为3 组，包括未转染组( HT-29 /PBS) 、阴性对照组( HT-29 / RNAi-NC) 和实验组( HT-29 /UbcH10-RNAi) 。取对数生长期的各组细胞胰酶消化后调节细胞浓度为 1.0 × 107 /mL。每只裸鼠接种200 μL 细胞悬液于一侧协腹皮下。接种8 d 后每4 d 测量1 次肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积。体积测量公式采用 V( mm3 ) = ab2 /2，其中a 为长径，b ＜ a。注射后第 36 d断颈处死裸鼠剥离肿瘤称重。

1.3 统计分析

应用SPSS 10.0 统计软件进行χ2 检验。数据统计以均数± 标准差(x±s) 表示，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 UbcH10 蛋白在转染HT-29 细胞中表达( 图 1)
图 1 Western blot 分析UbcH10 蛋白在转染 HT-29 细胞中表达

荧光显微镜下观察转染细胞，结果显示沉默细胞系中转染的表达载体稳定表达，而且细胞生长状态良好。Western blot 检测细胞中UbcH10 蛋白表达结果表明转染pUbcH10-RNAi 表达载体的细胞HT-29 /UbcH10-RNAi 中UbcH10 表达与对照组比较 ( HT-29 /PBS 和HT-29 /RNAi-NC) 明显降低。

2.2 UbcH10 沉默对裸鼠移植性大肠癌生长抑制作用( 图 2、3)
图 2 裸鼠肿瘤生长曲线

注: A: 各实验组对应的肿瘤照片; B: 不同组别的肿瘤质量分 析图; 与其他组比较，a P ＜ 0. 05。图 3 UbcH10 沉默对肿瘤生长抑制作用

通过裸鼠移植瘤模型观察UbcH10 沉默对肿瘤发生的抑制作用。结果显示，在接种肿瘤细胞后第8 d HT-29 /PBS 组和HT-29 /RNAi-NC 组裸鼠出现肉眼可见瘤体，而HT-29 /UbcH10-RNAi 组裸鼠在接种肿瘤细胞12 d 后才隐约可见瘤体。通过描绘肿瘤生长曲线( 图 2) ，UbcH10 表达下调可抑制裸鼠移植性大肠癌的形成和生长。裸鼠接种细胞36 d 后断颈处死，剥离肿瘤并称重。HT-29 / UbcH10-RNAi 组裸鼠肿瘤大小及重量均明显低于对照组，平均为对照组的40% 左右。表明UbcH10 沉默对裸鼠移植性大肠癌的生长具有抑制作用。

3 讨论

本研究成功构建的针对UbcH10 基因的RNAi 真核表达载体pUbcH10-RNAi 带有GFP 报告基因和 Kan /G418 耐受基因，属于shRNA 载体系统。该载体表达的短发夹RNA( shRNAs) 能在细胞内转变成具有siRNA 性质的短双联RNA。在构建的UbcH10 基因沉默细胞系HT-29 /UbcH10-RNAi 中，载体 pUbcH10-RNAi 稳定整合入细胞基因组中并产生了持续的基因沉默效应，为基因功能的研究提供了依据，特别是RNAi 高度的特异性以及技术流程简便、短周期、在细胞内表达的稳定性、可传递性、高效性等优势使其在肿瘤的基因治疗方面显示出应用前景。

泛素蛋白酶体系统( ubiquitin-proteasome system，UP-S) 对调控蛋白质的动态平衡起关键作用而且对调控细胞进展( 不论正常细胞还是肿瘤细胞) 起决定性作用。特异性干涉UP-S 的某一环节已被认为是一种很有前途的创新性抗肿瘤治疗方法。 UbcH10 作为E2 家族成员之一，自然也就成为肿瘤药物治疗开发的靶目标之一。Berlingieri 等[7]发现通过RNA 干扰封闭UbcH10 的蛋白质合成能抑制卵巢癌细胞株的生长，从而打开了基于UbcH10 合成和/或者功能抑制的某些卵巢癌的治疗前景。 Jiang 等[8]通过干扰途径敲除UbcH10 基因，结果发现不但能抑制胶质瘤细胞增殖，而且能通过下调 Bcl-2 促进胶质瘤细胞调亡。本研究成功建立了裸鼠移植性大肠癌模型，并且在UbcH10 基因沉默抑制大肠癌细胞增殖的基础上，在体内实验水平上证实了通过shRNA 沉默UbcH10 基因表达对大肠癌肿瘤的生长有抑制作用。因此，随着UbcH10 对肿瘤作用机制的深入研究以及从基础研究向临床应用研究的过渡，针对UbcH10 的干扰和抑制可能成为一种新型的临床分子靶点抗癌药物。

参考文献
[1] Boyle P,Ferlay J.Cancer incidence and mortality in Europe,2004[J].Ann Oncol,2005,16:481-488.
[2] 徐瑞华,邱妙珍.晚期结直肠癌化疗的研究进展[J].癌症,2008,27(6):661-666.
[3] 黄甜.大肠癌患者生存时间影响因素分析[J].中国公共卫生,2008,24(1):73-74.
[4] Lin Y,Hwang WC,Basavappa R.Structural and functional analysis of the human mitotic-specific ubiquitin-conjugating enzyme,UbcH10[J].J Biol Chem,2002,277(24):21913-21921.
[5] Gramont A,Ganier O,Cohen-Fix O.Before and after the spindle assembly checkpoint-an APC/C point of view[J].Cell Cycle,2006,5(18):2168-2171.
[6] Chen S,Chen Y,Hu C,et al.Association of clinicopathological features with UbcH10 expression in colorectal cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(3):419-426.
[7] Berlingieri M,Pallante P,Guida M,et al.UbcH10 expression may be a useful tool in the prognosis of ovarian carcinomas[J].Oncogene,2007,26(14):2136-2140.
[8] Jiang L,Bao Y,Luo C,et al.Knockdown of ubiquitin-conjugating enzyme E2C/UbcH10 expression by RNA interference inhibits glioma cell proliferation and enhances cell apoptosis in vitro[J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2010,136(2):211-217.