雌激素相关受体α、β、γ( estrogen related receptor α、β、γ，ERRα、β、γ) 是一类具有持续活化转录 活性的孤儿核激素受体^[1]。ERRα 被认为主要通过 与过氧化物酶体增殖物受体γ 共激活因子1α、1β ( PGC-1α、PGC-1β) 相互作用，共同调控氧化磷酸化 通路上的基因的转录，从而调控能量代谢的平衡。 除了参与调控能量代谢外，ERRα 还被认为是乳腺 癌、卵巢癌、结肠癌以及前列腺癌等多种癌症的预后 指标^{[2, 3, 4, 5, 6]}，因此，ERRα 也成为人们筛选治疗代谢疾 病和癌症药物的热门靶标。多项研究报道显示抑制 ERRα 的活性可以明显地抑制多种癌细胞的增 殖^{[7, 8]}。但迄今为止，并未找到ERRα 的激活剂。 本实验拟通过构建长期稳定表达的hERRα 慢病毒 载体并感染目的细胞，以进一步证实ERRα 的作用。

慢病毒三质粒包装系统质粒 pWPXLD、psPAX2 和pMD2.G，包装细胞293T 以 及大肠杆菌stbl 感受态均由中国科学院广州生物医 药与健康研究院惠赠。其中pWPXLD 为转移载体，编码绿色荧光蛋白( geen frorescence potein，GFP) ，两端的酶切位点分别为BamH I 和EcoR I; psPAX2 为包装载体; pMD2.G 为包膜蛋白质粒，三者均含 有巨细胞病毒启动子( ctomegalovirus pc30，romoter，CMV) 。293T 细胞是慢病毒的包装细胞，含有10% 胎牛血清( 10% FBS) 的DMEM 培养液培养。人肺 腺癌A549 细胞系购自美国ATCC 细胞库。

Dulbecco's modified eagle medium ( DMEM) 培养基( 美国Gibico 公司) ，胎牛血清( 美 国Hyclone 公司) ，pCMX-hERR 质粒为本组保存，SuperScriptTM Ⅲ RT 逆转录试剂盒( 美国Invitrogen 公司) ，各种限制性内切酶，连接酶及Cell-Titer Glo 试剂盒等( 美国Promega 公司) ，hERRα 抗体 ( 美国Cell Signaling 公司) ，β-actin 抗体( 美国Sigma 公司) 、磷酸氢二钠( Na₂HPO₄ ) 、羟乙基哌嗪乙 硫磺酸( Hepes) 、氯喹和Cacl₂ ( 美国Sigma 公司) ，化学发光免疫印迹( electrochemiluminescence western，ECL Western) 蛋白印迹检测试剂盒( 美国GE Healthcare 公司) ，其余常用试剂均为国产分析纯。

NCBI 基因 数据库检索hERRα 基因( NM． 198253) ，用primerpremier 5.0 软件设计引物，F: 5'-CGGGATCCATGTCCAGCCAGGTG-3'; R: 5'-CGGAATTCTCAGTCCATCATGGCC-3'。分别引入了限制性内切酶 BamH I 和EcoR I 的酶切位点，由上海生物工程技 术服务有限公司合成。以本组保存的pCMXhERRα 质粒为模板扩增目的片段。

BamH I 和EcoR I 限制性内切酶分别对转移质粒 pWPXLD 和纯化回收的PCR 产物进行酶切。胶回 收试剂盒回收纯化酶切后的目的片段( 按说明书进 行操作) ，T4 连接酶连接转移质粒和目的基因。

取10 μL 连接产物转化感受态stbl，氨苄 青霉素筛选阳性菌落，Qiagen endotoxiee． free Maxi 试剂盒快速大量提取质粒( 参照说明书操作) ，采用 紫外分光光度仪检测质粒的纯度及浓度并进行测 序，测序引物为F: 5'-TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC-3'; R: 5'-CATAGCGTAAAAGGAGCAACAT-3'。测序工作由上海生物工程技术服务有限公司完 成。

在转染前24 h，取长满的293T 细胞进行消化计数，以7.5 × 10⁶ cells /145 mm 培养 皿的细胞密度进行预板，使转染时的细胞的汇合度 在70% 为宜。在转染前2 h 细胞换液，加入 22.5 mL 37 ℃预热的培养基，重新放回37 ℃的5% 培养箱内培养。在15 mL 离心管中加入22.5 μg pWPXLD 或者pWPXLD-hERRα，14.6 μg pSPAX2，11.25 μg pMD2.G，再加灭菌水至1 012.5 μL，然后 再加入112.5 μL 2.5 mol /L 的CaCl₂ ，枪头吹打混 匀，然后再加入1.125 mL 2 × HEPES[羟乙基哌嗪 乙硫磺酸2-[4-( 2-hydroxyethyl )-1-piperazinyl ethanesulfonic acid，HEPES)]，反复吹打混匀，室温 放置15 min。逐滴将混合液( 2.25 mL) 加入293T 细胞中，再加入氯喹使其在培养基中的终浓度为 25 μmol /L，轻轻混匀培养基，放入37 ℃的5%培养 箱内培养14 ～ 16 h 后换液。吸去培养基，加入 15 mL /145 mm 培养皿( 6 mL /100 mm 培养皿) 新 鲜预热的病毒收集培养基，放回37 ℃的5%培养箱 内再培养至转染后48 h，每12 h 收集上清1 次，共3 次，2 000 r /min 离心5 min 去除细胞碎片。最后进 行浓缩: 用Beckman SW32 转子，70 000 × g 4 ℃离 心2 h，吸去上清，管底白色沉淀即为病毒粒子。每 管加入200 μL 磷酸盐缓冲溶液( phosphate buffered

用PBS 稀释病毒，进行10 倍梯度稀释，从10^-1 至10^-6，终体积 100 μL。在24 孔板内进行293T 细胞的预板，每孔 5 × 10⁴ ～ 1 × 10⁵ 个细胞，总体积500 μL，在细胞未 贴壁时每孔加入40μL 病毒液，轻柔且完全混匀细 胞，放回37 ℃ 的5% 培养箱内培养。细胞在感染 48 h后，用PBS 轻轻地洗两遍去除剩余的病毒粒 子，然后用500 μL LPBS 重悬细胞，用枪头反复吹 打混匀( 无需胰酶消化) ，用流式细胞仪检测带增强 型绿色荧光( enhanced green flrorescence protein，EGFP) 的细胞数。病毒滴度的计算公式为:

取对数生 长期的A549 细胞，以每孔4 × 10⁵ 个细胞的密度接 种于6 孔板。在细胞未贴壁时每孔根据病毒颗粒数 与细胞数比例为1∶ 3 加入Lenti-hERRα 或者空载体 对照病毒，轻柔且完全混匀细胞，放回37 ℃的5% 二氧化碳培养箱内培养。

A549 细胞感染病毒48 h 后，以每孔120 μL RIPA( radio immunoprecipitation assay) 裂解蛋白( 按照说明书操作) 。用BCA( Bicinchoninic acid) 法试剂盒测定所得蛋白样品的浓度，然后稀释样品至所有样品浓度相同。变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳( denaturing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 胶电泳待 溴酚蓝迁移到玻璃板底线，从电泳装置上卸下玻璃 板，准备转膜。转膜条件为100 V，60 min。接着分 别孵育一抗和二抗各1 h，最后显色。

取对数生长期的A549 细胞，以每孔 4 000个细胞的密度接种于96 孔板。在细胞未贴壁 时每孔加入M.O.I = 3 的Lenti-hERRα 或者空载体 对照病毒，轻柔且完全混匀细胞，放回37 ℃的5% 培养箱内培养，48 h 后检测cell-titer glo ( 按照说明 书操作) 。

图 1

注: A: DL2000; B: PCR 扩增片段; C: DL2000; D: BamH I 和EcoR I 限制性内切酶双酶切pWPXLD-hERRα 重组质粒3 h 后电泳条带。图 1 PCR 扩增hERRα 和酶切pWPXLD-hERRα

PCR 扩增获得的DNA 片段经1%琼脂糖凝胶电泳可见约1.5 kp 大小 明亮清晰的条带; 转移质粒pWPXLD 大小约10 kd，两者酶切后片段长度见图 1。Qiagen endotoxiec． free Maxi 试剂盒提取重组质粒DNA，测得OD 值260 / 280 = 1.78; BamH I 和EcoR I 双酶切后得到2 条明 亮清晰的条带，其中小者长约1.5 kp，与预期 hERRα 片段大小一致; 以测序引物对pWPXLDhERRα 重组质粒进行测序，测序结果与NCBI-Gene 数据库检索到的hERRα 基因( NM_004451.3) 序列 完全一致，表明重组质粒构建成功。

在293T 细胞感染10 倍梯 度稀释的lenti-GFP 病毒48 h 后，用流式细胞术检 测其中带GFP 的细胞百分数。结果显示随着病毒 浓度的增加，被感染细胞的百分比明显增加。病毒 稀释为10^-1 A549 细胞感染率为92.66%，10^-2为65.69%，10^-3 为13.95%，10^-4 为1.12%，10^-5为0.01%，10^-6为0，对照组未感染病毒细胞感染率均 为0。按公式计算出病毒滴度为1.8 × 10⁸ TU/mL。

图 2

注: 感染lenti-vector ( 左) 和lenti-hERRα ( 右) 48 h 后细胞内 hERRα 的蛋白。图 2 ERRα 在感染lenti-hERRα 病毒A549 中表达

使用慢病毒lenti-vector 和lentihERRα 感染A549 细胞。48 h 后，提取细胞的总蛋白，根据材料和方法所示，western blot 检测ERRα 的 表达。结果显示含有ERRα 的慢病毒，可以明显地 提高细胞ERRα 的表达。

使用慢病毒 lenti vector 和lenti-hERRα 感染A549 细胞48 h，根 据promega 公司cell-titer glo 说明书，检测ERRα 对 细胞增殖的影响，结果ERRα 可以明显增加A549 细胞增殖。

ERRα 是核激素受体家族的一员，因其结构与 雌激素受体( estrogen receptors，ERs) 具有很高的同 源性而得名，由Giguere 在1998 年针对ERαDNA 结 合域( DNA binding domain，DBD) 的保守序列，采用 低严谨度杂交方法筛选得到。ERRα 被认为是多种 癌症如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌的诊断靶 标^{[2, 3, 4, 5, 6]}。

慢病毒载体是一类来源于人类免疫缺陷病毒Ⅰ 型( human immunodeficiency virus type Ⅰ，HIV-Ⅰ病 毒的改良载体。为增加操作的安全性，人们常将携 带目的基因的载体、糖蛋白抗原/聚合酶( gag /pol) 及包膜蛋白( env) 构建在不同的质粒中。这些质粒 单独存在时既不能形成病毒颗粒，也不具备转导能 力，包装后能产生携带目的基因的重组慢病毒( 是 一类缺陷病毒) ，离开包装细胞后病毒颗粒仅能转 导细胞，但不能自我复制，其致病性大为降低^{[9, 10, 11]}。 一般说来，慢病毒载体既能感染分裂活跃期细胞，又 能高效率感染分裂缓慢或非分裂期的细胞; 能够携 带较大及多个外源性基因，转染后对转录沉默作用 有较强的抵抗力，能长期稳定表达目的基因。

本研究成功构建并包装了表达hERα 基因的重 组慢病毒载体，并发现过表达hERRα 促进了A549 细胞增殖，这与ERRA 抑制剂能抑制细胞增殖的发 现是一致的^[7]。此为进一步研究hERRA 基因的功 能及其在肿瘤发展中的作用奠定了基础。