儿童时期骨骼的正常发育是其健康成长的重要保证。骨钙素(osteocalcin，OC)和降钙素(calcitonin，CT)与机体骨骼发育关系密切。OC是维持和调节骨钙平衡，反应成骨细胞活性的特异而敏感的标志物。CT可增强成骨细胞活性，减弱破骨细胞活性，使骨组织钙盐沉积增加。血清中 OC和 CT含量能够较好反映骨代谢情况。遗传因素是影响骨代谢的重要因素之一。流行病学调查和全基因组扫描研究鉴定了许多与骨代谢有关的重要候选基因和候选区域。维生素 D受体 (vitamin D receptor，VDR)和雌激素受体(estrogen，ER)基因是研究最广泛的 2个候选基因，许多学者对 VDR和 ER的多态性与骨密度的关系进行了研究，并发现了一些有意义的线索^{[1, 2]}。为探讨 VDR和 ER基因多态性与钙代谢相关激素 OC和 CT的关系，本研究于 2005— 2006年以河南省某地部分汉族儿童为研究对象，采用聚合酶链反应 －限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphisms，PCR-RFLP)方法，检测 ERα基因 PvuⅡ和 XbaⅠ以及 VDR基因 FokⅠ基因多态性，并检测血清钙、 OC和 CT浓度，以期从基因水平探讨遗传因素对儿童骨代谢的影响。

选择河南省开封市开封县自然状况、经济条件、人口构成、农作物种类、生活习惯等均相似的 2个村作为调查区，整群抽取调查区 2所小学 8～12岁汉族儿童进行健康体检，排除肝、肾功能异常、遗传疾病患者及接受钙剂、激素替代治疗者;最终 140名儿童入选，平均年龄 9.61岁，其中，男童 76人，女童 64人。

血清 OC测定试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司，批号: 050625) ，血清 CT测定试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所，批号: 050625) 。放免仪采用 GC-400γ放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司) ，日立 Z-5000型火焰原子吸收分光光度计(日本日立公司) ，全血基因组抽提试剂盒(美国 Axygen Biosciences公司) 。

根据知情同意的原则，抽取空腹外周血分别进行血清激素测定及基因多态性分析。血清 OC和 CT浓度测定采用放免法^[3]。血清钙含量测定采用原子吸收分光光度法。实验 Ca回收率为 98.0%～110.2%，变异系数为 6.1%～12.2%。

采用 PCR-RFLP方法。基因组 DNA的提取应用全血基因组抽提试剂盒。以 ERα基因第 1内含子 PvuⅡ和 XbaⅠ以及 VDR基因 5'端第 2外显子 FokⅠ RFLP为检测标志物。根据文献^{[4, 5]}设计包含 PvuⅡ、 XbaⅠ和 FokⅠ切点的扩增片段引物。每个 PCR反应体系 50 μL，包括 ddH₂O 35.5 μL，10 × buffer 5 μL，MgCl₂ 1.5 mmol /L，脱氧核苷三磷酸 (deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP) 200 μmmol /L，Taq酶 2.5 U (日本 TaKaRa公司)上、下游引物各 0.4 μmmol /L，基因组 DNA 300 ng。PCR扩增条件为: 94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 35次; 72 ℃末端延伸 5 min。扩增产物限制性酶切位点分析为 20 μL反应体系，含扩增产物 5 μL，Pvu Ⅱ、 XbaⅠ或 FokⅠ内切酶 10 U(立陶宛 MBI公司) ，于 37 ℃水浴 3 h，反应产物分别经 1.5%和 2.5%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的数目和位置判定基因类型。以不出现或出现 PvuⅡ切点分别记做 P和 p，不出现或出现 XbaⅠ切点分别记做 X和 x;不出现或出现 FokⅠ切点分别记做 F和 f。

应用 HaploView软件对 ER基因 PvuⅡ和 XbaⅠ2个位点的多态性进行连锁不平衡分析。应用 SPSS 12.0软件对儿童血清 Ca、 OC和 CT水平进行单因素方差分析，以 α = 0.05为检验水平。

结果基因型分布均符合 Hardy-Wenberg平衡定律;分别为 ER Pvu Ⅱ: P = 0.669，ER Xba Ⅰ: P = 0.553，VDR FokⅠ: P = 0.850;认为所选对象可代表大规模人群，不存在明显的自然选择、迁移等因素对遗传平衡的影响。

男、女童血清 Ca浓度均值分别为 2.50和 2.46 mmol /L，血清 CT浓度均值分别为 198.02和 239.49 ng /mL，血清 OC浓度均值分别为 5.54和 5.67 μg /L，不同性别儿童 3种指标差异均无统计学意义(P ＞ 0.05) 。

表 1

表 1 ER PvuⅡ 3 种基因型儿童血清 Ca、 CT 及OC 浓度( x ± s) 比较

表 1 ER PvuⅡ 3 种基因型儿童血清 Ca、 CT 及OC 浓度( x ± s) 比较

携带纯合 pp基因型儿童血清 OC浓度高于另外 2组儿童，差异有统计学意义(P ＜ 0.05) ; ER PvuⅡ各基因型之间血清 Ca、 CT浓度差异无统计学意义(P ＞ 0.05) 。

携带 ER XbaⅠ3种基因型儿童血清 Ca浓度分别为 XX 2.59 mmol /L，Xx 2.40 mmol /L，xx 2.52 mmol /L;血清 OC浓度分别为 XX 5.71 μg /L，Xx 5.03 μg /L，xx 6.04 μg /L;血清 CT浓度分别为 XX 187.57 ng /mL，Xx 212.09 ng /mL，xx 234.89 ng /mL，携带不同基因型儿童 3种指标差异均无统计学意义(P ＞0.05) 。

表 2

表 2 VDR FokⅠ3 种基因型儿童血清 Ca、CT 及OC 浓度( x ± s) 比较

表 2 VDR FokⅠ3 种基因型儿童血清 Ca、CT 及OC 浓度( x ± s) 比较

儿童血清 CT及 OC浓度与 VDR FokⅠ基因型无关(P ＞ 0.05) ;携带 ff基因型儿童血清钙浓度高于其余 2组儿童，差异有统计学意义(P ＜ 0.05) 。

ER有 ERα和 ERβ 2种亚型，研究发现两者在介导雌激素参与骨代谢过程中所起的作用可能不同^[6]。ERα基因 PvuⅡ和 XbaⅠ多态位点位于第 1内含子上，其基因型可能与骨密度有关^[6]。本研究中携带 ER PvuⅡ纯合 pp基因型儿童血清 OC浓度高于另外 2组儿童，提示 ER PvuⅡ多态性可能影响 OC的合成和分泌。有学者在体外培养的人牙周膜细胞中加入雌激素，结果显示细胞分泌的 OC明显增多^[7]。ER表达于所有与骨形成和骨吸收相关的细胞成分中，而 OC是反应成骨细胞活性的特异而敏感的标志物，因此，ER基因的遗传多态性可能对雌激素的结合及生物学活性产生影响，进而可能影响骨钙素基因表达的活性，导致骨钙素合成改变。 VDR基因定位于第 12号染色体上，是一种调节基因转录的生物大分子。VDR基因的遗传多态性可能对维生素 D的结合及生物学活性产生影响，进而影响钙磷代谢。VDR FokⅠ多态性位点的改变可能影响 VDR基因 mRNA的表达与稳定性，造成其受体蛋白在数目或活力上的细微差异，进而出现对其所调节基因的反式放大作用，表现为骨密度及相关代谢指标的较大差异^[8]。本研究结果显示，携带 ff基因型儿童血清 Ca浓度高于其余 2种基因型儿童，差异有统计学意义，提示血清钙水平受 VDR基因 FokⅠ多态性的影响。Abrams等^[9]研究表明，VDR FokⅠ基因多态性通过影响钙的吸收而参与骨代谢，与本次研究一致。但不同地区、不同种族之间研究结果并不一致;李颖等^[10]在对哈尔滨男性 VDR基因多态性与骨密度关系的研究中未发现 VDR FokⅠ基因多态性与骨密度有关。

由于机体骨代谢受多种因素影响，同时存在多基因联合作用，因此，要确定基因多态性与骨代谢的关系，还需要进一步扩大样本量，并增加多态性位点进行检测。