手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，多发于 5岁以下婴幼儿，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症^[1]，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡^[2]。在临床上 EV71与 CoxA16感染所引起的 HFMD难以区别，由于 EV71还能够引起多种与神经系统相关的疾病，逐渐地为各国卫生工作者所重视^[3]。EV71属于小 RNA病毒科，主要由 VP1、VP2、VP3和 VP4 4种外壳蛋白构成。其中 VP1蛋白是病毒中和决定因子，直接影响到病毒的抗原性，VPl基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，可作为肠道病毒属内不同血清型分类依据和小 RNA病毒科内不同属的分类参考^[4]。研究 VP1区的基因序列突变情况对了解 EV71的变异情况具有重要的流行病学意义^[2]。本研究对黑龙江省哈尔滨市 2008年—2010年 HFMD患者样本 EV71型病毒 VP1区基因序列进行分析，动态监测肠道病毒 71型 VP1基因变化趋势，为哈尔滨市 HFMD预防和控制策略的制订提供重要科学依据。

2008—2010年哈尔滨市哨点医院(儿童医院和传染病医院)送检的 HFMD病例患儿的咽拭子或肛拭子，标本采集方法参照《手足口病预防控制指南》 ^{[5, 6]}执行，4 ℃暂存并于 12 h内送达实验室，－ 70 ℃冰箱保存。

核酸提取仪(德国 QIAGEN公司) ，PCR仪(美国 Bio-Rad公司) ，电泳仪(北京六一仪器厂) ，凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公司) ，核酸提取试剂盒(德国 QIAGEN公司) ，RTPCR试剂盒(德国 QIAGEN公司) 。

VP1区全基因扩增及基因测序 2008—2010年 EV71核酸检测阳性标本每年随机抽取 12份，共计 36份标本进行 VP1区特异性引物全基因扩增。将 36份标本采用 RT-PCR法进行 VP1区全基因扩增，反应体积(25 μL) ，DEPC处理的水 6.0 μL，2 × PCR反应缓冲液 12.5 μL，Platinum Taq酶混合液 1.0 μL，RNA标本 5.0 μL; 20 μmol /L VP1-F、VP1-R引物各 0.25 μL，参考文献 ^[7]设计的引物序列为: EV71-VPl-F (上游) : 5'-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3'，EV71-VPl-R (下游) : 5'-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC-3'。反应条件为:逆转录 50 ℃ 30 min，预变性 95 ℃ 15 min。扩增程序为 94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;最后延伸 72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，共筛选出阳性样品 31份。阳性样品送上海生工生物工程有限公司进行正、反向测序。

31份 EV71 VP1区基因测序结果经 DNA Man和 DNA Star软件进行核苷酸序列的校正整理和核苷酸和氨基酸序列比对分析;用 DNA Star软件对 EV71病毒的国内外代表毒株 VP1核苷酸序列进行进化分析，构建系统进化树。

随机抽取 36份 EV71型核酸阳性标本进行 VP1区特异性引物全基因 RT-PCR扩增，扩增产物目的片段为 1 082 bp，共筛选出阳性样品 31份。

图 1

图 1 2008年EV71 VP1基因序列比对结果

图 2

图 2 2009年EV71 VP1基因序列比对结果

图 3

图 3 2010年EV71 VP1基因序列比对结果

应用 DNA Man和 DNA Star软件进行基因组序列分析，结果表明 2008年 12份样品间核酸序列比对同源性为 83.9%～98.8% ，2009年 9份样品间核酸序列比对同源性性为 97.9%～99.2% ，2010年 10份样品间核酸序列比对同源性性为 95.5%～99.8% 。

2008年 EV71VP1氨基酸序列有 4处存在差异，2009年 EV71VP1氨基酸序列只有 1处存在差异，2010年 EV71VP1氨基酸序列有 2处存在差异。2008年核酸序列第 65位出现 A-G互换，核酸序列第 66位出现 A-C互换，导致氨基酸第 22位出现 H-Q-R互换;核酸序列第 434位出现 A-G互换，导致氨基酸第 145位出现 E-G互换;核酸序列第 739位出现 A-C-T互换，导致氨基酸第 247位出现 L-I互换;核酸序列第 865位出现 A-G互换，导致氨基酸第 289位出现 A-T互换。其他位点的基因序列变异均属于无义突变。2009年核酸序列第 793和 794位出现 AA-CC互换，导致氨基酸第 265位出现 P-K互换。其他位点的基因序列变异均属于无义突变。2010年核酸序列第 355位出现 A-C互换，导致氨基酸第 119位出现 M-L互换;核酸序列第 865位出现 A-G互换，导致氨基酸第 289位出现 A-T互换。其他位点的基因序列变异均属于无义突变。

图 4

图 4 2008-2010年哈尔滨地方株进化树

图 5

图 5 2008-2010年哈尔滨地方株与标准株亲缘性系统进化树

通过 DNA Star软件构建 2008—2010年分离株间的氨基酸进化树。图 4进化树显示，2008—2010年流行株的氨基酸序列呈多条传播链，从各传播链每年度随机选取 1支代表株与从 GenBank下载国内外不同地区 A基因型和 B1-B4、C1-C5亚型代表株的 VP1区序列作为参考序列^{[8, 9, 10, 11]}进行基因分析，构建氨基酸进化树(图 5) ，更为直观地反映出 2008—2010年流行株的分子流行病学特征。图 4和图 5进化树显示，31份 EV71病毒其中有 16条氨基酸序列与北京的 FJ439769代表株 100%相同，2008年有 2条氨基酸序列与北京的 FJ606450代表株 100%相同。由亲缘关系进化树可见 31条 EV71型 VP1序列与国内 6条 EV71 C4亚型代表株 VP1序列间亲缘关系均较近，且有多条传播链，表明哈尔滨市存在亲缘关系较近的 EV71多传播链病毒同时流行，应加强监测与分析。

本研究结果表明，哈尔滨市 2008—2010年 31份 EV71型 VP1基因核苷酸序列为 C基因型 C4亚型，属于中国大陆流行的优势基因亚型。

McMinn等^[12]发现可能正是由于 HFMD的分离株其第 170位氨基酸缬氨酸变为丙氨酸这一个变化，导致其毒力发生根本的改变。Kung等^[13]发现第 251位苏氨酸使 EV71成为温度敏感性突变株并使毒株的神经毒性减低。以上研究表明 EV71毒力决定簇在基因组并非单一位点，如要确定 HFMD EV71型 C4基因型相关神经毒性毒力位点，尚需要更多不同病例分类的基因组数据来进行分析，同时还需要考虑宿主自身的免疫力状况^[13]。本研究对 31份哈尔滨市 EV71型流行株 VP1区基因氨基酸编码序列分析显示，2008年氨基酸第 22位、第 145位、第 247位、第 289位; 2009年氨基酸第 265位; 2010年氨基酸第 119位、第 289位发生变化，2009年和 2010年 EV71 VP1基因序列相对稳定。上述 EV71 VP1核甘酸序列变化导致的氨基酸位点的变化能否对病毒的致病性产生影响有待进一步研究探讨，同时这些氨基酸位点的变化能否改变 VP1蛋白的空间结构尚需进一步研究证实，空间结构的改变与 HFMD发病的致病力、传播力和毒力的联系也有待于进一步的研究。

哈尔滨市在 2008年以前尚未进行 HFMD的病原学监测工作，无该方面的基础数据。本研究的完成，为哈尔滨市手足口 EV71病毒病原学监测工作积累了基础性资料。哈尔滨市手足口 EV71病毒的氨基酸及基因的变异情况，有待于在今后的工作中逐步积累数据，及时掌握变异情况，为有效预防控制 HFMD提供良好的基础。