中国公共卫生  2012, Vol. 28 Issue (8): 1065-1067   PDF    
引用本文
邢晓越, 李冰, 李炜, 王欣, 李昕, 孙婷, 孙贵范. tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(8): 1065-1067.
XING Xiao-yue, LI Bing, LI Wei, et al. Protective effects of tert-butylhydroquinone on NaAsO2-induced cytotoxicity in HaCaT cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(8): 1065-1067.
tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞损伤保护作用
邢晓越, 李冰 , 李炜, 王欣, 李昕, 孙婷, 孙贵范    
中国医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室砷生物学作用评价及砷中毒防治辽宁省重点实验室, 辽宁 沈阳 110001
收稿日期: 2011-08-27.
基金项目: 国家自然科学基金(81172611,81072243);辽宁省教育厅科学技术研究项目(L2010704)
作者简介: 邢晓越(1986- ),女,四川人,硕士在读,研究方向:砷所致氧化应激.
通讯作者: 李冰,E-mail:libing@mail.cmu.edu.cn
摘要: 目的 探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO2)致人皮肤角质细胞系HaCaT细胞损伤的保护作用.方法 用Alamar Blue还原法检测细胞活力,用荧光探针2',7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成,用硫代巴比妥酸(TBA)法检测细胞内过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)的生成.结果 NaAsO2(25、50μmol/L)单独处理后,各组细胞活力明显下降(P<0.01),分别为82%和59%;细胞经tBHQ(25、50μmol/L)预处理后,tBHQ 25μmol/L组细胞活力分别恢复至(101.44±1.63)%和(92.06±9.95)%,tBHQ 50μmol/L组细胞活力分别恢复至(98.88±2.03)%和(91.12±7.87)%;NaAsO2(25、50μmol/L)单独处理后,各组细胞内ROS水平明显上升(P<0.01),分别为对照组的1.64和3.86倍;细胞经tBHQ(25、50μmol/L)预处理后,tBHQ 25μmol/L组ROS水平分别下降为对照组的0.95和1.87倍,tBHQ 50μmol/L组ROS水平分别下降为对照组的0.79和1.69倍;NaAsO2(25、50μmol/L)单独处理后,细胞内MDA含量明显上升(P<0.01),分别为2.28、2.96 nmol/(mgμprot);细胞经tBHQ(25、50μmol/L)预处理后,tBHQ 25μmol/L组MDA含量分别下降为2.05、2.43 nmol/(mgμprot),tBHQ 50μmol/L组MDA含量分别下降为2.10、2.60 nmol/(mg.prot).结论 tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞损伤具有保护作用,且具有一定的剂量-反应关系.
关键词: 亚砷酸钠(NaAsO2)     叔丁基对苯二酚(tBHQ)     HaCaT细胞    
Protective effects of tert-butylhydroquinone on NaAsO2-induced cytotoxicity in HaCaT cells
XING Xiao-yue, LI Bing , LI Wei, et al    
Department of Occupational and Environmental Health, College of Public Health, China Medical University, Shenyang, Liaoning Province 110001, China
Abstract: Objective To study protective effect of tert-butylhydroquinone in HaCaT cells on the damage induced by NaAsO2 in vitro.Methods Alamar Blue reduction rate was used to evaluate cell vitality.The level of reactive oxygen species(ROS)was detected by staining cells with 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA).The melondiadehyde(MDA)level was measured by thiobarbituric acid(TBA)method.Results The viability of HaCaT cells was decreased by 82% and 59% after exposed to NaAsO2 at the concentrations of 25 μmol/L and 50 μmol/L but the viability was 92% and 91% for the two exposure groups pretreated wtih tert-butylhydorquinone(tBHQ).Comparted to the control groups,the level of ROS increased by 1.64 and 3.86 times in the HaCaT cells exposed to 25 μmol/L and 50 μmol/L NaAsO2 but only by 0.95 and 1.87 times for the same exposure groups pretreated with 25 μmol/L tBHQ and by 0.79 and 1.69 times for the two groups pretreated with 50 μmol/L tBHQ.The MDA levels increased significantly in HaCaT cells exposed to NaAsO2(2.28 mol/L/mg·prot for 25 μmol/L NaAsO2 exposure,2.96 mol/L/mg·prot for 50 μmol/LNaAsO2 exposure; P < 0.01)and the increased levels of MDA were 2.05 μmol/L/mg·prot and 2.43 mol/L/mg·prot for 25 μmol/L pretreatment of tBHQ and 2.10 nmol/mg · prot and 260 nmol/mg · prot for 50 μmol/L/L tBHQ pretreatment groups.Conclusion tBHQ could protect HaCaT cells from damage induced by NaAsO2 in a dose-reaction manner.
Key words: sodium arsenite(NaAsO2)     tert-butylhydroquinone(tBHQ)     HaCaT cell    

长期砷暴露可发展为机体多器官肿瘤，其中皮肤就是砷中毒的主要靶器官之一，因此，研究砷暴露对皮肤角质细胞的损伤作用并寻找有效的治疗手段具有重要的现实意义[1]。研究发现，叔丁基对苯二酚( tert-butylhydroquinone，tBHQ) 具有较强的细胞保护作用，可增强原代培养的人和大鼠肝细胞的抗氧化能力[2]，并能有效抑制类神经元PC12 的细胞凋亡[3]。本研究选用人永生化表皮细胞HaCaT 细胞系，观察tBHQ 对无机砷致人皮肤角质细胞损伤的保护作用，为寻找针对慢性砷中毒皮肤损害的有效控制和治疗手段提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

超净工作台( 苏净集团安泰公司) ; CO2 恒温培养箱( 荷兰Heraeus 公司) ; 全自动酶标仪( 芬兰Labsystems 公司) ; 流式细胞仪( 美国 BD 公司) 。亚砷酸钠( sodium arsenite，NaAsO2 ) ( 美国Fluka 公司) ; 胰蛋白酶( 美国Hyclone 公司) ;胎牛血清( 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司) ; 磷酸盐缓冲液、tBHQ、Alamar Blue、2'，7'-二乙酰二氯荧光素( 2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA) ( 美国Sigma 公司) ; 丙二醛( malon dialdehyde，MDA) 测定试剂盒( 南京凯基生物科技发展有限公司) 。

1.2 细胞系

人永生化表皮细胞HaCaT 细胞系 ( 中国典型培养物保藏中心，GDC 106) 。 1.3 细胞培养和处理HaCaT 细胞株在5% CO2、 37 ℃条件下常规培养于完全培养基，隔日换液。待细胞进入对数生长期，未预处理组细胞直接加入含有0、25、50 μmol /L 的NaAsO2培养基处理24 h; 预处理组细胞经tBHQ( 25、50 μmol /L) 预处理12 h，再与NaAsO2不同浓度组共同处理24 h。

1.4 细胞活力测定

参照文献[4]采用Alamar Blue 还原法进行细胞活力测定。

1.5 活性氧( reactive oxidative species，ROS) 水平测定

参照文献[5]采用DCFH-DA 检测细胞内 ROS 水平。

1.6 MDA 水平测定

参照试剂盒说明书采用硫代巴比妥酸( thiobarbituric acid，TBA) 法检测细胞内 MDA 的生成水平。

1.7 统计分析

应用SPSS 16.0 软件进行单因素方差分析( one-way ANOVA) ，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同NaAsO2染毒浓度组的Alamar Blue 还原率( 表 1 )
表 1 不同NaAsO2 染毒浓度组的Alamar Blue 还原率(x ± s，n = 4，%)

25、50 μmol /L NaAsO2单独作用于 HaCaT 细胞24 h，Alamar Blue 还原率均明显低于 0 μmol /L 组，且呈剂量－ 反应关系，差异均有统计学意义( F = 379.99，P ＜ 0.01) ; 经tBHQ 预处理12 h 后，再与不同浓度的NaAsO2共同处理，则Alamar Blue 还原率与相同浓度NaAsO2单独暴露组比较明显恢复，差异均有统计学意义( F = 175.520、25.333，P ＜0.01) 。而相同浓度砷暴露情况下，25和50 μmol /L tBHQ 预处理组之间的Alamar Blue 还原率无明显差异。

2.2 不同NaAsO2染毒浓度组的细胞内ROS 荧光强度( 表 2)
表 2 不同NaAsO2 染毒浓度组的细胞内ROS 荧光强度(x ± s，n = 3)

NaAsO2( 25、50 μmol /L) 单独作用于 HaCaT 细胞24 h，细胞内ROS 荧光强度明显高于 0 μmol /L 组，且呈剂量－ 反应关系，差异有统计学意义( F = 79.531，P ＜ 0.01) ; 经tBHQ 预处理12 h 后，再与不同浓度的NaAsO2共同处理，则细胞内荧光强度与相同浓度NaAsO2单独暴露组比较明显降低，差异均有统计学意义( F = 24.687、48.164，P ＜ 0.01) 。而相同浓度砷暴露情况下，25 和50 μmol /L tBHQ 预处理组之间的细胞ROS 荧光强度无明显差异。

2.3 不同NaAsO2染毒浓度组的HaCaT 细胞MDA 生成情况( 表 3)
表 3 不同NaAsO2 染毒浓度组的细胞内MDA 生成 情况［x± s，n = 3，nmol /( mg·prot) ］

NaAsO2单独作用于HaCaT 细胞 24 h，细胞内MDA 的生成明显高于0 μmol /L 组，且呈剂量－ 反应关系，差异有统计学意义( F = 51.938，P ＜ 0.01 ) ; 经tBHQ 预处理12 h 后，再与不同浓度的NaAsO2共同处理，细胞内MDA 的生成与相同浓度NaAsO2单独暴露组比较明显降低，差异均有统计学意义( F = 4.743、 64.262，P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01 ) 。且相同浓度砷暴露情况下，25 μmol /L tBHQ 预处理组细胞内 MDA 的生成水平明显低于50 μmol /L tBHQ 预处理组( F = 51.411，P ＜ 0.05 ) 。

3 讨论

本研究发现，NaAsO2单独作用HaCaT 细胞 24 h，可降低细胞活力，增加细胞内ROS 和MDA 的产量; 在给予tBHQ( 25、50 μmol /L) 预处理后，即可明显恢复这种由NaAsO2所引起的细胞损伤状况。 大量砷对皮肤角质细胞影响的体内外研究证实，无机砷能诱导人皮肤角质细胞损伤，低浓度NaAsO2 可降低HaCaT 细胞活力，引起细胞内活性氧族( reactive oxygen species，ROS) 产生，ROS 的产生可损伤脂质，并引起细胞内脂质过氧化的产物MDA 含量明显增多[6]。这些改变可进一步抑制重要的DNA 修复蛋白———多聚( ADP-核糖) 聚合酶的活性，最终导致DNA 氧化损伤加重[7]。还有研究发现，tBHQ 预处理能阻断小鼠胚胎成纤维细胞中亚砷酸钠诱导的细胞毒性和细胞凋亡，并可逆转多种无机砷诱导的基因表达[8]。本课题组前期研究也表明，tBHQ 预处理可降低Chang 肝细胞中NaAsO2导致的细胞毒性，增强细胞对NaAsO2 毒性的抵抗能力[9]。本文则就tBHQ 能否有效抑制砷引起的人皮肤角质细胞损伤进行了初步的研究。有关tBHQ 作用机制的研究初步认为，tBHQ 可能通过延缓Nrf 2 降解速率，引起胞浆Nrf 2 积累入核，稳定核中Nrf 2 不被降解[3]，而使胞核Nrf 2 含量增加并激活下游靶基因的转录，有效干扰异源性有毒化合物在体内的代谢过程，并减少毒性代谢产物的生成，从而保护机体减轻损伤。综上所述，tBHQ 对无机砷致人皮肤角质细胞的损伤具有保护作用。

参考文献
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