萜类化合物泛指存在于自然界中、分子式为异戊二烯单位倍数的烃类及其衍生物，包括醇、醛、酮、 羧酸、酯等化合物，是植物挥发油中的主要组分，如香雪兰( Freesia hybrida) 挥发油中芳樟醇的含量高达30.51%^[1]，藤椒( Zanthoxylum Schinifolium) 挥发油中含有丰富的芳樟醇、柠檬烯、桧烯、月桂烯、大根香叶烯和石竹烯^[2]。大量研究表明，植物挥发油成分具有抑制或杀死细菌、真菌等微生物的特性^{[3, 4, 5, 6, 7]}。 与植物挥发油抑菌作用研究相比，单组分的抑菌研究较少，为了解萜类对黄曲霉的抑菌作用，本次实验选择香叶烯、松油烯、芳樟醇、金合欢烯、罗勒烯、石竹烯、柠檬烯等常见的萜类化合物作为研究对象，比较不同萜类对黄曲霉的抑菌活性，期望能为减轻黄曲霉菌对食品及其原料的污染提供新技术。

黄曲霉菌株由河南科技学院食品学院提供。培养基为PDA 固体培养基: 马铃薯( 去皮) 200 g，葡萄糖20 g，琼脂18g，水1 000 mL，自然 pH 值。

SW-CJ-2A 超净工作台( 苏州自动化仪器仪表研究所有限公司) 、LDZX-50FA 高压灭菌器( 上海申安医疗器械厂) 、Olympus 光学显微镜( 日本Olympus 公司) 、PYX-300Q-A 人工气候箱( 广东医疗器械厂) 。香叶烯( β-myrcene，90%) 、罗勒烯( β-ocimene，＞ 90%) 和柠檬烯( limonene，97%) 3 种萜类( 瑞士Fluka 公司) ，松油烯 ( γ-terpinene，98%) 和芳樟醇( ± linalool，97%) ( 比利时Acros 公司) ，95%的金合欢烯( farnesene) ( 美国Phero Tech 公司) 和97% 的蒎烯( α-pinene) ( 德国Roth 公司) 。

使用PDA 平板测定法。将经灭菌后PDA 培养基倒入直径为100 mm 的培养皿中制成平板，再用灭菌消毒过的打孔器在备用的黄曲霉菌种上打孔( 5 mm) 。待平板凝固后接入已培养好的、生长一致的直径为5 mm 的相应菌饼1 块。然后接入萜类挥发物，具体方法是在每个培养皿中放置1.5 mL 离心管盖，并用微量移液器加入挥发物，加入的量分别为1、2、4、8 μL，对照仅放入不加任何物质的小盖，最后用密封膜密封培养皿，每个处理重复4 次。在28 ℃条件下培养72 h 后用十字交叉法测量菌落直径。计算公式分别为: 菌落生长直径( mm) =菌落直径( 6 次平均值)-5 mm; 抑制率( %) = ( 对照菌落生长直径-处理菌落直径) /对照菌落生长直径×100%。

在无菌条件下，将供试菌种接种到PDA 斜面培养基上，培养72 h 所得的黄曲霉孢子用10 mL 无菌水冲洗至50 mL 的三角瓶中，加入0.1%( V /V) 的吐温80，振荡2 h，通过血球计数板计数法调节孢子悬液浓度至106 个/ mL。然后用载玻片法测定不同处理后黄曲霉菌孢子的萌发率。具体方法如下: 先在载玻片上加1 滴PDA 培养基，随即滴加孢子悬浮液，迅速盖上盖玻片，放入灭过菌的培养皿中再用密封膜密封培养皿。28 ℃下培养8 h，在Olympus 光学显微镜下放大40 × 10 倍观察孢子萌发数，每个样品观察10 个视野。计算公式分别为:孢子萌发率( %) =萌发的孢子数/孢子总数×100%; 孢子萌发抑制率( %) = ( 对照孢子萌发率-处理孢子萌发率) /对照孢子萌发率×100%。

采用spss 16.0 软件分析实验数据，用单因素方差分析( anova) 对不同萜类之间和同种萜类不同浓度之间的抑菌作用进行统计学检验，同种挥发物不同浓度之间的差异用lsd 多重比较方法进行两两比较。孢子萌发率取反正弦转换 ( arcsin√x) 后的角度值进行分析。

表 1

表 1 7 种萜类对黄曲霉菌丝生长的影响

表 1 7 种萜类对黄曲霉菌丝生长的影响

除1 μL 的香叶烯、金合欢烯、β-罗勒烯和α-蒎烯以外，其他处理均表现出不同程度的抑菌活性。香叶烯在4 个浓度梯度下对黄曲霉菌丝的抑菌效果无差异。4 和8 μL浓度下γ-松油烯的抑菌作用大于1 和2 μL。芳樟醇和 α-蒎烯对菌落的抑制率强弱顺序均为8 μL ＞4 μL ＞2 和1 μL。1 μL 金合欢烯和β-罗勒烯的抑菌效果均低于其他3 种浓度。8 μL 的柠檬烯抑菌效果优于1、2和4 μL。

表 2

表 2 7 萜类对黄曲霉孢子萌发的影响

表 2 7 萜类对黄曲霉孢子萌发的影响

在1、2、 4 μL浓度下香叶烯对孢子的萌发率均无明显影响; 1 μL的罗勒烯、1 μL γ-松油烯对黄曲霉孢子萌发率的抑制作用与对照组比较无差异，除此之外均对黄曲霉孢子萌发有一定的抑制作用。在测试的4 种浓度中，8 μL罗勒烯和柠檬烯对孢子的抑制率最高; 不同浓度松油烯和蒎烯对孢子的抑制率为8 μL ＞ 4 μL ＞2 μL ＞1 μL;与对照组比较，芳樟醇在4 种浓度下均能极明显地抑制孢子萌发金合欢烯在8 和4μL 的浓度下对孢子萌发率的抑制作用优于2 和1 μL。

本研究结果表明，芳樟醇对黄曲霉的抑制作用最强，芳樟醇是一种含羟基的单萜类化合物。以往研究表明，含羟基的单萜化合物对真菌和细菌的抑菌活性高，原因在于羟基的存在及其相对较高的水溶性^{[8, 9, 10]}。而芳樟醇的抑菌机制在于能够抑制细胞的呼吸作用和改变细胞膜的通透性^{[11, 12]}。柠檬烯能有效抑制黄曲霉、寄生曲霉、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、啤酒酵母和面包酵母^{[13, 14, 15]}，可见该萜是广谱性抑菌化合物，研究表明其抑菌机理是改变细胞膜结构和降低细胞膜总脂肪酸含量^{[16, 17]}。松油烯也是广谱性的抑菌化合物^[18]，但其作用机制尚不明确。Filipowicz 等^[19]发现α-蒎烯对细菌和真菌均有一定的抑菌作用，与本次研究结果相似，其抑菌作用可能是通过破坏细胞的完整性、抑制呼吸、提高质膜通透性、阻断离子传递和分离线粒体来实现的^[20]。研究表明罗勒烯这种单萜化合物对多种真菌都有抑制作用^[21]，尽管目前对其抑菌机理尚不明确，但可以肯定的是其能导致细胞膜损伤和细胞死亡。

有关香叶烯抑菌作用的报道较少，且都证明了该化合物抑菌活性很低^{[22, 23]}，这可能与其化学结构中无羟基和环状结构有关^[8]。尽管有研究认为Psiadia 属的植物精油对细菌和真菌的抑制活性归因于包括金合欢烯在内的多种萜类物质^[24]，但是缺乏直接的证据，本次研究结果对这一推论提供了依据。 本研究初步探讨了7 种萜类物质对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，结果证实萜类挥发物普遍对黄曲霉有抑菌活性，但是抑菌强弱有较大差异，要筛选出抑菌活性高的挥发物还需要对更多萜类进行研究。