赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA) 是1 种具有多种毒性的真菌毒素^[1]，广泛污染粮食和饲料^[2]，对人类和动物的健康及农业经济发展造成严重威胁^[3]。OTA 的检测方法正在不断发展，从灵敏度、 准确性、重现性、简易性、批量性和可视性等各方面日益满足实际生产生活的需求。本文对OTA 的多种分析检测技术，包括高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、免疫渗滤测定法、免疫层析测定法、荧光偏振免疫测定法、免疫传感器和电化学免疫测定法等方法的最新进展综述如下。

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC) 是基于目标检测物的物理和化学性质建立的分析技术，也是国际上最常用、最通用的 OTA 检测方法^{[4, 5, 6]}。国际官方化学家联合会(the Association of Official Analytical Chemists International，AOAC) 采用IAC-HPLC-FL 为大麦(AOAC official method，2000，03) ^[4]、咖啡(AOAC official method，2000，09) ^[5]、啤酒和葡萄酒(AOAC official method，2001，01) ^[6]中OTA 检测的官方推荐方法。

HPLC 法是从样品提取，纯化，用正相色谱柱或反相色谱柱的样品分离，及最后紫外检测器(ultraviolet detector，UV) 、荧光检测器(fluorescence detector，FL) 或质谱检测器(mass spectrometry，MS) 对 OTA 含量进行测定的过程，可用于大麦^[7]、小麦^[8]、 玉米^[9]、咖啡豆^[10]等农产品、各种酒类^[11]和饮品、 血样^[12]和尿液^[13]等体液、肾脏和肌肉^[14]等组织器官以及空气^[15]中OTA 的检测。应用HPLC 法对白酒、玫瑰酒、葡萄汁和血样等多种复杂样品检测时，由于样品基质中可能存在杂质的干扰作用，HPLC 法检测前的样品提取和纯化工作十分重要^{[11, 12, 13]}。

样品中毒素的提取和纯化是影响HPLC 方法的重要部分。常用的OTA 提取方法有多种试剂种类和组成，主要由极性有机溶剂与酸构成，包括: 甲醇、 乙腈、氯仿或二氯甲烷添加硫酸、盐酸、磷酸或柠檬酸等。样品基质不同，适用不同组分的提取试剂。 对于含脂类和类固醇类的样品提取过程，提取试剂需添加正己烷或环己烷去除杂质。初提样品的纯化常用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE) 、固相柱 (solid phase extraction，SPE) 或免疫亲和柱(immunoaffinity column，IAC) 完成。固相柱的填充材料包括纤维素、硅胶、离子交换柱^[16][近期也常用分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIP) 作为固相柱填充材料]。2004 年，Maier 等^[17]应用MIP 制成的固相纯化柱纯化红酒提取液，用HPLC-FL 检测样品中OTA 的含量，方法的检测限(limit of ditection，LOD) 为0.01 ng /mL，定量限(limit of qualification，LOQ) 为0.033 ng /mL。2007 年，Wei 等^[18]对该方法经改造，应用MIP 制备成微型固相纯化柱，用 HPLC-FL 检测红酒中OTA 含量，方法的LOD 为 0.04 ng /mL，LOQ 为0.10 ng /mL，整个方法的测定时间在40 min 完成。基于MIP 建立的纯化方法，保证了免疫纯化法中抗体对毒素的选择性，又兼备了传统固相纯化柱对极端试剂的耐受性，成为样品提取和纯化工作的研究热点。免疫亲和柱是利用抗体对抗原的特异性结合作用建立的纯化方法，相对于传统固相柱具有特异性强的优点，但由于其本身为蛋白质，容易受极性溶剂等影响破坏其生物活性因素的影响。主要表现为样品提取时无法去除的多种杂质化合物，其中有些物质可能影响免疫亲和柱中抗体与毒素的结合或降低亲和柱对毒素的吸附能力，削弱检测灵敏度。另外，样品提取中存在的某些化合物也可能影响毒素的结构使其不能被萃取或不能被抗体识别从而影响结果^{[19, 20]}。如红酒中OTA 含量检测，由于红酒中存在花青苷等色素类物质，影响样品纯化过程中OTA 与免疫层析柱内抗体的结合，最终可能使HPLC 检测结果呈现假阳性^[19]。另有实验表明，酸性液提取OTA 时，样品提取液中的杂质影响OTA 与亲和柱的结合，使回收率随样品基质差异降低10% ～ 40% 不等^[20]，碱性液提取OTA 时，OTA 的环状结构会被打开变成开环OTA，而后者无法被OTA 的抗体识别，影响OTA 与抗体的反应，降低检测结果和回收率。除此之外，样品中也可能有ochratoxin B(OTB) 或ochratoxin C(OTC) 存在，而多数OTA 的抗体对其结构类似物OTB 或OTC 具有交叉反应性，从而提高样品中OTA 检测值和回收率，使检测结果呈现部分假阳性。2007 年，Giraudi 等^[21]应用组合合成法获得可与OTA 高亲和力结合的六肽，并用其作为填充材料制备成免疫亲和纯化柱，成功用于酒中OTA 的检测，LOD 为0.1 ng /mL。 这种生物多肽选择性适体的应用规避了传统免疫纯化柱中抗体材料生产中对动物的依赖性，具有通过生物工程技术大量生产的可行性，该技术的应用值得继续深入研究。

由于OTA 结构中含有化学发光基团，可以直接使用荧光检测器对色谱柱分离后的OTA 进行测定。 荧光检测器比紫外检测器灵敏，OTA 的HPLC-FL 方法的LOD 可以达到0.01 ng /mL，样品检测限多在 0.12 μg /kg 左右^[19]。OTA 的HPLC-MS 检测法与 HPLC-FL 法灵敏度接近，检测限也能达到十分之一纳克级^[22]，也是一种很灵敏的检测方法。相比之下，检测OTA，HPLC-FL 法更加常用。

一方面，HPLC 检测结果相对准确、可靠，灵敏度高，重现性好，可以同时检测多种目标物，又适用于多种农产品、食品和生物源物质中OTA 的实验室检测; 另一方面，其设备昂贵，对样品中毒素纯度的要求较高，样品的前处理繁琐、复杂，导致检测成本高、周期长，检测工作需要一定的经验和熟练的技术，一定程度上无法满足广大市场对检查方法的经济低耗、方便、快速及高通量测定等方面的需求。

酶联免疫检测法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 是通过抗原与抗体在均相或非均相的反应体系中结合，引起标记酶与底物的显色反应，利用分光光度计对反应体系中显色反应引起的光密度变化进行测定，以此得知样品中OTA 浓度的方法，其中基于抗OTA 单克隆抗体的ELISA 检测法比较常见，样品检测限可达0.1 ng /g^[23]。

OTA 的ELISA 检测法包括直接竞争ELISA(direct-competement ELISA，dc-ELISA) 和间接竞争 ELISA (indirect-competement ELISA，ic-ELISA) 2 种模式，各有特点; dc-ELISA 的反应步骤少，分析时间短，交叉反应性也相对较低，但由于一抗参与标记而使其免疫反应性降低，从而降低检测灵敏度; ic-ELISA 由于使用了二抗的间接反应，扩大免疫反应信号，提高灵敏度，但也同时增加了反应步骤，延长了测试时间^[24]。

OTA 的ELISA 检测法研究始于19 世纪70、80 年代，如今，ELISA 是应用最广泛的OTA 免疫学检测法，已经有商品化试剂，方法简单、容易操作，但其研究工作始终没有终止，包括传统ELISA 法的优化，例如，优化OTA 偶联反应获得高免疫原性的完全抗原，调整动物免疫程序产生高效价的自然抗体，改良杂交瘤筛选方法获得高特异性高产量的抗体生产细胞株及ELISA 反应条件的优化，包括反应时间、反应温度和缓冲液的选择样品提取液组成等。 近期有创造性的研究热点包括: (1) 针对抗原: 应用化学合成或生物淘选法获得模拟OTA 结构的分子或化合物; (2) 针对抗体: 应用化学合成或生物淘选法获得模拟抗OTA 抗体的活性物质^[25]。刘荣仁等^[26]应用OTA 单克隆抗体从随机肽库中淘选模拟 OTA 抗原的七肽，并应用该多肽模拟替代自然毒素作为抗原建立OTA 的ELISA 检测方法，该方法的线性范围是200 ～ 8 000 pg /mL，LOD 是150 pg /mL，添加回收率为83% ～ 116%，检测23 份样品的检测结果与传统ELISA 一致性良好，与OTB 的交叉反应率为35%，与橘青霉、展青霉、AFB₁、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的交叉反应率均< 0.01%，具有很好的特异性和灵敏度。该方法不仅为检测方法的安全性提供了解决方案，更为其他真菌毒素检测方法中材料的研究工作给予了重要的启示。开发包括单链抗体的多种基因工程抗体或化学合成抗体模拟物，以克服自然抗体的不易保存、基因不稳定和生产规模小等局限，是ELISA 检测法研究的另一热点^[27]。Van Houwelingen 等^[28]报道了应用羊驼生产抗OTA 的抗体重链的可变区抗体(variable region ofheavy-chain antibodies，VHH) ，并建立抗OTA 的 VHH 的噬菌体抗体库，用筛选的多种特异性抗体分别建立ELISA 检测法，50% 反应抑制浓度(concentration of 50% inhibition，IC₅₀) 为12 ～ 442 ng /mL; 该方法探索了VHH 抗体在ELISA 检测法中的应用，开辟了抗体材料研究的新途径。

由于真菌毒素是小分子物质，抗原与抗体的结合表位少，检测真菌毒素的ELISA 方法基本是竞争反应模式^{[29, 30, 31]}。近期，ELISA 检测法反应模式的研究出现了新的亮点。2007 年，Suzuki 等^[32]报道了应用抗ZEN 抗体的重链可变区(variable region of heavy chain，VH) 、轻链可变区(variable region of light chain，VL) 片段建立夹心ELISA 法，即把蛋白标记VL 作为捕获抗体，酶标记VH 作为反应抗体，当毒素存在时，捕获抗体和反应抗体与毒素结合，在酶底物作用下显色，对样品中毒素的含量进行测定。 该方法的LOD (约为20 ng /mL) 高于竞争模式 ELISA 法的检测限，但其是对真菌毒素传统竞争模式局限的突破。OTA 的抗体可变区夹心ELISA 法有待进一步研究。

由于ELISA 是基于抗原抗体免疫反应的检测法，而呈现比HPLC 法检测范围窄、灵敏度低的劣势; 并且可能由于样品基质对抗体的影响而产生分析值偏低或偏高的假阴性或假阳性检测结果，有时需要借助可靠的仪器分析方法对ELISA 法结果进行验证。除此之外，人工操作程序也会使结果产生波动，通过免疫检测方法与计算机控制操作程序结合的自动分析方法的应用和可靠的、规范的实验室操作程序的推广将是这一问题的有效解决办法。然而，ELISA 方法具有样品少，样品纯化过程相对简单，批量检测性，商品化，高特异性等优点。不容忽视的是，由于基因工程抗体和化学合成模拟抗体等新型免疫反应材料的研究必将给ELISA 方法带来新的发展契机。

与ELISA 法原理基本相同，不同的是，在膜或凝胶柱构成的垂直反应体系的重力渗滤过程中完成显色和测定^{[33, 34, 35]}。该类方法中直接竞争模式的膜载体酶联免疫渗滤测定法比较多见。

De Saeger 等^[33]建立了OTA 的纤维素膜免疫渗滤测定法，检测限是4 μg /kg，对21 份样品进行检测，假阴性和假阳性率分别是4% 和2%，与HPLCFL 进行比较，结果一致性较高，该方法可用于小麦、 大麦、黑麦和玉蜀黍的检测。Saha 等^[34]应用纯化柱、层析柱串联，在层析柱的纤维素膜上铆定aflation B₁ (AFB₁) 和OTA 的特异性抗体，建立了对辣椒中AFB₁ 和OTA 同时测定的膜免疫渗滤测定法，对AFB₁ 和OTA 定量检测限分别为2、10 μg /kg，该方法与液相检测方法检测结果具有良好的一致性。 Rusanova 等^[35]对凝胶式免疫渗滤测定法进行了优化，在亲和柱前加阴离子纯化柱，用该方法对红酒类物质进行检测，最低检测限是2 ng /mL，该方法的结果可视性优于纤维素膜式渗滤测定法。虽然目前免疫渗滤测定法的检测限相对高于其他方法，但具有直观定性、无需仪器等明显优势，成为仪器检测方法的有力补充，可应用于样品OTA 污染筛选的定性检测和场地检测。

免疫层析测定法(immunochromatography，ICG) 是一种简易、快速的免疫检测技术。其与ELISA 法一样，分为直接竞争法和间接竞争法。反应中可用的标记物质包括酶、胶体金、脂质体等。其中，胶体金免疫层析试纸条检测法避免了酶标记反应中底物显色步骤，反应结果容易保存，成为研究热点。其反应原理是以条状层析材料为载体，样品溶液通过毛细管作用在层析条上泳动，样品中的毒素经过层析条上的胶体金标记抗体区与抗体发生特异性结合，免疫复合物随层析作用涌动，被富集并截留在固定了抗原的检测带上，样品中的毒素与固定的毒素竞争结合抗体呈现显色反应，抗原抗体复合物继续涌动，遇到固定了二抗的质控线呈现显色反应，结果判定方法: 质控线和检测线都显色为阴性; 检测线无色，质控线显色，为阳性; 对照线和检测线都不显色，为检测试纸条质量问题^[36]。

2005 年，Cho 等^[30]应用抗OTA 的单克隆抗体做胶体金试纸条，检测限500 ng /mL。在检测体液或植物饲料样品的提取液时灵敏度低，认为可能是在胶体金与抗体结合物铆钉在膜上经干燥后，抗体复合物的移动性不好; 还可能是其在移动过程中与膜形成非特异性结合，减弱了检测信号。作者针对该问题并给出了两点建议: 将测试条的膜部分制成包含含水滤纸的复合条，增加含水量，并封闭保存; 把检测限前移，缩短检测限与胶体金抗体复合物的距离，降低抗原抗体复合物与膜的非特异性结合。 2008 年，Liu 等^[31]用OTA-keyhole limpet hemocyanin (KLH) 做免疫原制备杂交瘤细胞株，生产单克隆抗体，在cd-ELISA 方法中，IC₅₀ 是0.32 ng /mL，基于该抗体建立胶体金检测试纸条，OTA 的检测限是5 ng /mL。用于检测咖啡样品时，试纸条的检测结果与cd-ELISA 的结果具有很好的一致性。2009 年，Lai 等^[37]应用噬菌体肽库中筛选的OTA 模拟多肽替代OTA 毒素组装成胶体金免疫层析试纸条，检测限是10 ng /mL，与OTA-bovine serum albumin(OTABSA) 为抗原组装的胶体金试纸条和ELISA 方法的测试结果进行比较，结果显示检测玉米样品时，应用模拟肽为抗原组装的免疫层析试纸条的检测结果与其他2 种方法具有很好的一致性。ICG 属于半定量检测方法，方法的准确性需通过大量的样本检测和方法比较进行验证，必要时需通过HPLC 法对样品进行精确测定或确证。但是，该方法具有可视性好、 操作简单、检测结果长期稳定，是样品污染筛查和场地检测的良好选择。

荧光偏振免疫测定法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 是荧光物质经偏振光照射后进入激发状态发出光子，检偏器对平行和垂直方向的偏振强度进行检测，偏振强度与溶液中荧光基团的分子大小有关，分子越大偏振强度越高，分子越小偏振强度越小，即，抗体与荧光示踪物结合产生的偏振强度比游离示踪物产生的偏振强度大。当采用均相竞争荧光偏振分析法对毒素进行测定时，样品中待检毒素和荧光标记毒素与抗体竞争结合，样品中毒素越多，溶液中游离的荧光标记毒素越多，偏振光信号越弱，相反，样品中毒素越少，荧光标记毒素与抗体结合越多，偏振信号越强。此方法已经用于fumonisin B₁ (FB₁) 、deoxynivalenol(DON) 、AFB₁ 和OTA 的检测。

2004 年，Shim 等^[38]建立OTA 的FPIA 检测法，检测范围是5 ～ 200 ng /mL，最低检出限是3 ng /mL，在没有经过样品纯化处理下，回收率就可以达到欧盟检测方法的要求，是一种灵敏的OTA 检测方法。应用该法对26 份自然污染的大麦样品进行检测且与 ELISA 检测值进行比较，其中16 份样品中OTA 含量的FPIA 检测值均低于ELISA 检测值，提示前者相对于后者可能受样品基质影响小。2009 年，Zezza 等^[39]基于抗OTA 的单克隆抗体建立OTA 的FPIA 检测法，检测范围是2.0 ～ 5.0 ng /mL，平均回收率是79%，检测限是0.7 ng /mL。用该方法检测154 份红酒样品，并用HPLC 验证，相关系数r = 0.922 2，没有假阳性和假阴性出现; 该方法适用于红酒中 OTA 含量检测，更适用于基质干扰物少的白酒和玫瑰酒的检测。

FPIA 反应与其他免疫反应一样，可能受基质干扰，一般通过样品提取液在检测前稀释、纯化和以基质为分析校准物等方法去除干扰。但是由于检测原理不同，FPIA 相对于ELISA 对纯化的要求降低，甚至无需对样品进行纯化。另外，FPIA 检测法是一种均相反应，不需对结合物和未结合物进行分离，所需检测步骤少、时间短^[40]。可应用不同荧光集团标记多种毒素应用FPIA 法对多种毒素进行同时检测。 虽然目前FPIA 法不能同时检测多种毒素、不是批量检测方法，但由于其分析步骤简单，连接小型检测器时具有快速检测的优势而呈现良好的发展前景。

免疫传感器(immunosensor，IS) 是一种固相免疫分析的检测器，主要包括生物敏感元件(包括酶、 抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质) 、换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等) 和信号数据处理器。随着生物传感器的敏感元件和换能器的发展，已被广泛关注的包括: 表面等离子体共振免疫传感器(surface plasmon resonance inmmunosensor，SPR) 、压电免疫传感器、电化学传感器、光导纤维免疫传感器等。虽然已经有很多种生物芯片，但是目前SPR 最适用于毒素的检测。SPR 检测毒素的原理是金属膜表面的结合物可以改变金属膜的屈光指数。SPR 对由于物质结合产生的反射光角度或密度的微小变化进行测定，测定的信号强度受表面物质数量影响。SPR 的优点是不需要竞争反应或标记试剂即可进行测定。近几年，这类检测装置的研制大量涌现，多样的装置很多已经商品化。 由于抗体分子远远大于抗原分子，所以很多SPR 采用固定抗原的方法进行检测，这种模式已经用于多种真菌毒素的检测^[41]。

2007 年，Adanyi 等^[42]介绍了检测AFB₁ 和OTA 的光波导模式谱(optical waveguide lightmode spectroscopy，OWLS) 间接竞争法，检测范围是0.5 ～ 10 ng /mL，分析小麦和大麦样品中的OTA 和AFB₁ 时，与ELISA 法的相关性分别为0.96 和0.89。 2007 年，Tsai 等^[43]应用石英晶体微量天平传感器 (quartz-crystal microbalance immunosensor，QCM) 检测OTA，固定OTA 抗体，使OTA 和OTA-BSA 竞争结合，方法的LOD 是16 ng /mL。2009 年，Vidal 等^[44]报道了检测OTA 的金包石英晶体压电免疫传感器检测法。该方法结合流动注射系统，对OTA 的检测限是10 ～ 128 ng /mL，LOD 是8 ng /mL。该方法有固定抗原或抗体2 种方式，主要优势是不需要标记试剂。2006 年，Alarcón 等^[29]首次建立了碳丝网印刷电极OTA 的电化学免疫传感器检测方法。 其中直接法和间接法的检测范围分别是0.05 ～ 2.5 和0.1 ～7.5 ng /mL，IC₅₀ 分别是(0.35 ± 0.04) 和(0.9 ±0.1) ng /mL，检出限分别是0.06 和0.1 ng /mL。直接法对小麦样品的IC₅₀ 是0.2 ng /mL，相当于1.6 μg /kg，检出限是0.4 μg /kg。该方法与AOAC 2000.03 的IAC-HPLC 方法进行比较，相关系数r =0.9992。

免疫传感器由于其响应快和同步显示，可以节省时间并对反应动力曲线进行观测等优点，成为现代免疫学检测方法和仪器自动化结合的免疫检测发展的研究热点^[45]。由于生物传感器稳定性和重现性等方面尚不成熟，该技术尚处于实验室研究阶段，通过计算机技术、材料技术和生物技术等相关技术的发展，以及从单一检测指标到多项检测指标的研究，生物传感器的检测技术会很快应用于实践检验中。

电化学免疫测定法(electrochemical immunoassay，EI) 是根据溶液中离子变化产生的信号作为检测指示的技术，与酶显色的光度检测技术和荧光检测技术均为信号采集技术的发展。电化学技术可以与酶联免疫技术联合成电化学酶联免疫分析法，也可以与免疫传感器联合成为电化学免疫传感器测定技术。

Liu 等^[41]应用1，6-己二硫醇(1，6-hexanedithiol) 和胶体金制成容易吸附OTA 的完全抗原电极，使OTA 完全抗原和待检样品中OTA 与OTA 抗体竞争结合，通过酶解反应，应用差动脉冲伏安法检测溶液中离子变化情况。这种变化与样品中OTA 的含量成反相关，建立了较灵敏的电化学免疫检测方法。 其检测范围是0.01 ～ 0.1 ng /mL，检测限是8.2 pg /mL。Alarcon^[29]应用电化学法建立了电极免疫传感器，检测小麦中的OTA。该方法与HPLC 的一致性良好。电化学免疫分析法具有检测限低，灵敏度高的优点，可以与多种方法结合产生新型的免疫检测技术。

由于OTA 对食品和饲料的污染水平一般在ng / kg ～ mg /kg，对痕量OTA 的检测分析需要灵敏、特异的方法，这包括采样、毒素提取、样品纯化和检测分析4 个步骤，是一个整体的、系统的分析过程。首先，样品的采集是样品污染情况分析的重要影响因素，遵循规范的采样规程是获得真实结果的必要保证。其次，对不同基质样品中毒素的有效提取和纯化十分重要。MIP 柱纯化法将对毒素提取与纯化研究产生一定的推动作用。除此之外，由于自然界中多种毒素共存，对不同理化性质毒素的同步提取方法的研究更有待开展。最后，一种新方法的有效性不仅需要实验室内对方法的技术指标进行评估及对大量自然样本的检测分析，更需要实验室间的合作、 其他可靠方法的验证和参考样品的确证，才能保证分析方法的确实可行、准确可靠。

OTA 的检测分析方法随着免疫学、物理化学、 生物学及仪器工程等多学科理论与技术发展和交叉研究，已取得长足进步。目前，OTA 检测法的研究热点，不仅包括尚处于实验室研究阶段新兴的快速检测方法的实用性研究，也包括可能对检测分析法产生深远影响的新兴技术的研究，如化学合成模拟抗体或生物工程抗体，化学合成或生物模拟毒素替代自然毒素等等。总之，建立结合各种分析检测技术优势和不断创新更准确、灵敏、方便、经济的检测方法，实现OTA 的快速、实时、自动化、高通量及多种毒素的同步检测分析将是未来的发展方向。