茶多酚对甲基汞致大鼠神经毒性影响

引用本文

刘巍, 徐兆发, 邓宇, 徐斌, 杨海波. 茶多酚对甲基汞致大鼠神经毒性影响[J]. 中国公共卫生, 2012, 28(7): 951-953. 复制到剪切板

LIU Wei, XU Zhao-fa, DENG Yu. Effect of tea polyphenols on neurotoxicity induced by methylmercury in rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2012, 28(7): 951-953. 复制到剪切板

茶多酚对甲基汞致大鼠神经毒性影响

刘巍, 徐兆发 , 邓宇, 徐斌, 杨海波

中国医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室, 辽宁沈阳110001

收稿日期: 2011-02-21.

基金项目: 国家自然科学基金(81172631)

作者简介: 刘巍(1986- ),男,辽宁沈阳人,硕士在读,主要从事重金属毒理学研究。

通讯作者: 徐兆发,E-mail:zfxu@mail.cmu.edu.cn

摘要: 目的研究甲基汞致大鼠神经毒性的作用机制,探讨茶多酚对甲基汞致神经毒性作用的影响。方法 36只Wistar大鼠随机分成3组,对照组,染汞组(12μmol/kg),茶多酚干预组(1 mmol/kg),连续干预染毒4周,最后1次染毒后24 h,将大鼠麻醉后处死,断头取脑,冰浴下分离大脑皮质,测定Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶活力及细胞内Ca²⁺、活性氧簇(ROS)含量及细胞凋亡情况。结果与对照组比较,单纯染汞组Na⁺-K⁺-ATP酶[(2.72±0.46)μmol/(h.mg)]、Ca²⁺-ATP酶活力[(1.52±0.26)μmol/(h.mg)]明显降低(P<0.01),细胞内Ca²⁺含量(239.52±44.84)nmol/L、ROS含量(313.86±35.11)及细胞凋亡率[(40.84±6.26)% ]明显升高(P<0.01);与染汞组比较,茶多酚干预组Na⁺-K⁺-ATP酶活力[(3.58±0.71)μmol/(h.mg)]、Ca²⁺-ATP酶活力[(1.98±0.29)μmol/(h.mg)]明显升高(P<0.05或P<0.01),细胞内Ca²⁺含量(188.39±7.43)nmol/L、ROS含量(238.03±22.99)及细胞凋亡率[(28.31±4.34)% ]明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论茶多酚对甲基汞致大鼠神经毒性有一定拮抗作用。

关键词: 甲基汞神经毒性茶多酚

Effect of tea polyphenols on neurotoxicity induced by methylmercury in rats

LIU Wei, XU Zhao-fa , DENG Yu,et al

Department of Environmental Health, School of Public Health, China Medical University, Shenyang 110001, China

Abstract: Objective To examine the effect of tea polyphenols on toxic effect induced by methylmercury. Methods Thirty-six Wistar rats were randomly divided into 3 groups by weight.The first group was control group;the second group was treated with 12μmol/kg CH₃HgCl;the third group was the tea polyphenols pretreatment group.The pretreatment and CH₃HgCl treatment lasted for 4 weeks.Twenty four hours after the last treatment,the activities of Na⁺-K⁺-ATPase and Ca²⁺-ATPase,the contents of Ca²⁺ and reactive oxygen species,the levels of apoptosis in pallium were determined. Results Compared with the control group,the activities of Na⁺-K⁺-ATPase(2.72±0.46μmol/[h·mg]) and Ca²⁺-ATPase(1.52±0.26μmol/[h·mg])decreased significantly(P<0.01)and the content of Ca²⁺ (239.52±44.84 nmol/L),the content of reactive oxygen species(313.86±35.11 fluorescence intensity),and the level of apoptosis(40.84±6.26%)increased significantly(P<0.01 for all)in CH₃HgCl treatment group.Compared with CH₃HgCl treatment group,the activities of Na⁺-K⁺-ATPase(3.58±0.71μmol/[h·mg])and Ca²⁺-ATPase (1.98±0.29μmol/[h·mg])increased significantly(P<0.05,P<0.01)and the content of Ca²⁺(188.39±7.43 nmol/L),the content of reactive oxygen species(238.03±22.99 fluorescence intensity)and the level of apoptosis (28.31±4.34%)decreased obviously in the tea polyphenols pretreatment group(P<0.05,P<0.01,and P<0.01). Conclusion Tea polyphenols has a protective effect on the neurotoxicity induced by methylmercury in rats.

Key words: methylmercury neurotoxicity tea polyphenols

汞在自然界有三种存在形式: 元素汞、无机汞和有机汞，其中以甲基汞(methylmercury，MeHg) 的神经毒性最为严重^[1]。过量生成的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 与甲基汞神经毒性有密切关系^[2]。Ca^{2 +} 是甲基汞所致神经毒性的关键因子，ROS 与Ca^{2 +} 可以相互作用，二者共同诱导神经毒性的发生^{[3, 4]}。茶多酚(tea polyphenols，TP) 是天然抗氧化剂，可有效清除人体内活性氧自由基^[5]。本研究通过观察茶多酚对甲基汞中毒引起的大脑皮质 Na ⁺ -K ⁺ -ATP 酶、Ca^{2 +} -ATP 酶活力，Ca^{2 +}、ROS 含量及细胞凋亡变化的影响，探讨甲基汞致神经毒性的机制及茶多酚的保护作用。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

高速分散均质机(上海标本模型厂) ; KS-150 型超声波细胞破碎机(宁波科生仪器厂) ; 2-16K 低温超速离心机(美国Sigma 公司) ; 722 分光光度计(上海第三分析仪器厂) ; FACSCAN 流式细胞仪(美国Becton Dickison 公司) ; F-4500 荧光分光光度计(日本HICATHI 公司) ; 氯化甲基汞(CH₃HgCl，纯度97%，德国Dr-Ehrenstorfer 公司) ; 茶多酚(长沙蓝威生物制品有限公司) ; DCFH-DA 荧光染料、Fura-2 /AM 荧光染料(美国Sigma 公司) ; 细胞凋亡测试盒(南京凯基生物科技发展有限公司) 。

1.2 动物分组及染毒

健康成年清洁级Wistar 大鼠(中国医科大学实验动物中心) 36 只，体重(180 ± 10) g，雌雄各半。许可证号: SYXK (辽) 2003-0013。正式实验前适应性饲养7 d，按体重随机分成 3 组，每组12 只。对照组，染汞组，茶多酚干预组。前2 组空腹以大豆油灌胃，茶多酚干预组空腹灌胃 1 mmol /kg 茶多酚; 2 h 后，对照组腹腔注射生理盐水，染毒组与茶多酚组同时腹腔注射12 μmol /kg CH₃HgCl。干预隔日1 次，染毒每日1 次，连续干预与染毒4 周。干预与染毒容量均为5 mL /kg。

1.3 样品采集及处理

最后1 次染毒后24 h，各组取8 只大鼠，乙醚麻醉后处死，断头取出完整大脑，冰浴下切取大脑皮质，制备5% 匀浆液待用; 各组其余4 只大鼠，操作相同，制备单细胞悬液待用。

1.4 指标测定及方法

Na ⁺ -K ⁺ -ATP 酶及Ca^{2 +} -ATP 酶活力的测定采用硫酸亚铁钼磷蓝定磷法^[6]; 细胞内Ca^{2 +}、ROS 含量及细胞凋亡情况的测定应用流式细胞仪; 蛋白含量的测定采用Lowry 法^[7]。

1.5 统计分析

实验数据以x±s 表示。采用 SPSS 11.5 软件进行统计学分析，采用单因素方差分析进行组间差异的显著性检验，两组间比较用 LSD-t 检验(least-significant difference t-test) 。当 P ＜ 0.05 时，为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同组别大鼠大脑皮质Na ⁺ -K ⁺ -ATP 酶及 Ca^{2 +} -ATP 酶活力(表 1)

表 1 各组大鼠大脑皮质Na ⁺ -K ⁺ -ATP 酶及 Ca^{2 +} -ATP 酶活力(x±s，n = 8)

与对照组比较，染汞组大鼠大脑皮质Na ⁺ -K ⁺ -ATP 酶及Ca^{2 +} -ATP 酶活力明显降低(t = 6.007、5.668，P ＜ 0.01) ; 与染汞组比较，茶多酚干预组大鼠大脑皮质Na ⁺ -K ⁺ -ATP 酶、 Ca^{2 +} -ATP 酶活力明显升高(t = 2.865、3.294，P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01) 。

2.2 不同组别大鼠大脑皮质细胞内Ca^{2 +} 及ROS 含量(表 2)

表 2 各组大鼠大脑皮质细胞Ca^{2 +} 及ROS 含量(x±s，n = 4)

与对照组比较，染汞组大鼠大脑皮质细胞内Ca^{2 +} 及ROS 含量(用平均荧光强度表示) 明显升高(t =6.380、12.644，P ＜ 0.01) ; 与染汞组比较，茶多酚干预组大鼠大脑皮质细胞内Ca^{2 +}、ROS 含量明显降低(t =2.250、3.614，P ＜0.05 或P ＜0.01) 。

2.3 不同组别大鼠大脑皮质的细胞凋亡率

给予大鼠干预与染毒4 周后，与对照组[(3.27 ± 1.09) %]比较，染汞组大鼠大脑皮质细胞凋亡率 [(40.84 ± 6.26) %]明显升高(t = 11.834，P ＜ 0.01) ; 与染汞组比较，茶多酚干预组大鼠大脑皮质细胞凋亡率[(28.31 ± 4.34) %]明显降低(t = 3.292，P ＜ 0.01) 。

3 讨论

谷氨酸(glutamate，Glu) 是中枢神经系统具有代表性的兴奋性氨基酸^[8]，正常情况下，神经元和胶质细胞之间的谷氨酸处于动态平衡状态。当谷氨酸释放增加，胶质细胞重摄取功能下降时，就会导致兴奋性毒性。谷氨酸作用于细胞膜上的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA) 受体，升高细胞内 Ca^{2 +} 浓度，造成钙超载，最终导致细胞死亡^{[9, 10]}。

兴奋性毒性与氧化损伤相互联系，兴奋性毒性可引起ROS 生成增加; 氧化损伤也可以加剧兴奋性毒性^[11]。神经细胞过度兴奋导致胞内Ca^{2 +} 浓度升高，可通过一系列途径增加ROS 生成; 反过来，ROS 可通过动员线粒体内Ca^{2 +} 释放，增加胞浆游离的 Ca^{2 +} 水平而加剧兴奋性毒性，最终激活核酸内切酶，导致DNA 双链破坏从而诱发细胞凋亡^[12]。

茶多酚是天然抗氧化剂，能有效清除自由基，抑制过氧化反应^[13]。本实验通过预先给予大鼠茶多酚后再染汞，发现大脑皮质细胞内ROS 含量明显降低，Ca^{2 +} 含量明显降低，表明茶多酚可能通过对自由基的清除，同时改善细胞内钙超载，从而减轻细胞凋亡。因此，茶多酚对甲基汞所致的神经毒性具有一定的保护作用。

参考文献

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中国公共卫生 2012, Vol. 28 Issue (7): 951-953	PDF