铅是环境中广泛存在的重金属污染物，对全身血液、神经、肾脏、内分泌和免疫等各系统产生毒性作用。铅暴露所致神经细胞氧化应激是铅神经毒性的重要表现之一，特别是对于正处于生长发育中的中枢神经系统而言，异常的氧化应激不可避免地对脑正常结构和功能带来不可逆转的严重损害^[1]。 本研究拟用不同剂量铅对人神经母细胞瘤SH-SY 5 Y 细胞进行染毒，观察铅对神经细胞的氧化损伤及神经细胞对铅的氧化应答，探讨神经细胞对铅暴露产生氧化应激应答的可能机制。

MCO-15 AC 型CO₂ 培养箱 (日本SANYO 公司) ，Mini P-4 型电泳仪(北京凯元信瑞仪器有限公司) ，Mode 1680 型酶标仪(美国 Bio-Rad 公司) ，Gene-Gnome HR 55 000 型荧光化学发光凝胶分析系统(美国Synoptics 公司) ; 醋酸铅 (美国Sigma 公司) ，胎牛血清、高糖型改良的Eagle 培养基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM) 、胰蛋白酶(美国Gibco 公司) ，微量还原性 GSH 试剂盒(南京建成生物研究所) ，2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA) 探针(美国Sigma 公司) ，蛋白激酶C-δ (protein kinase C-δ，PKC-δ) 兔抗人单克隆抗体、酪氨酸激酶2(casein kinase 2，CKⅡ) 羊抗人单克隆抗体、核因子E 2 相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf 2) 兔抗人单克隆抗体(美国 Santa Cruz 公司) ，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 小鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥公司) ，辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase，HRP) 标记的羊抗兔抗体、 HRP 标记的兔抗羊抗体、HRP 标记的羊抗小鼠抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) ，其他试剂均为国产分析纯。

SH-SY 5 Y 细胞株用含10% 胎牛血清的培养基在37℃、5% CO₂ 的条件下培养。实验共分4 组，醋酸铅终浓度为0、5、25、125 μmol /L，分别作为对照组和低、中、 高染毒剂量组，每组设3 个平行样。醋酸铅染毒24 h 后收集细胞用于后续试验。

用DCFH-DA 法测定将细胞接种到96 孔板，待细胞贴壁吸弃培养基，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS) 润洗2 次后，对细胞进行染毒，37 ℃，5 % CO₂ 培养箱中孵育2 h 后吸弃培养基，PBS 润洗2 次，每孔加终浓度为10 μmol /L 的 DCFH-DA 应用液200 μL，37 ℃，5 % CO₂ 培养箱避光静置30 min 于激发波长485 nm，逸出波长 525 nm下测各孔荧光强度并对结果进行分析。

用二硫基双硝基苯甲酸(dithiothymine double-nitrobenzonic acid，DTNB) 法检测GSH 水平，按不同剂量铅对细胞染毒24 h 后，用微量还原性GSH 试剂盒测定每组细胞中GSH 并对结果进行分析。

参照文献[2, 3]用蛋白印迹(western blot) 法分别测定胞浆和胞核中Nrf 2 蛋白水平以及细胞总蛋白中 PKC-δ 和CKⅡ蛋白水平。待测蛋白的表达水平用其条带的总灰度值与内参蛋白(GAPDH) 条带的总灰度值相比之后，再以对照组为参照进行校正得到相对灰度值。

应用SPSS 16.0 进行单因素方差分析和最小显著差法分析，检验水准α = 0.05。

表 1

表 1 铅对细胞中ROS 和GSH 水平的影响(n = 6，x±s)

表 1 铅对细胞中ROS 和GSH 水平的影响(n = 6，x±s)

结果表明，对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的ROS 荧光强度呈明显的上升趋势，中、高剂量组和对照组之间的差异有统计学意义(P ＜ 0.05) ，高剂量组和低剂量组之间的差异有统计学意义(P ＜ 0.05) ，其余组间差异不明显。对照组、低剂量组、 中剂量组和高剂量组的GSH 相对浓度呈明显的下降趋势，与对照组相比，各组差异均有统计学意义 (F = 0.000，P ＜ 0.01) 。结果提示，铅能导致SH-SY 5 Y 细胞氧化损伤，随铅浓度增加，氧化损伤加重。

图 1

注: 与对照组比较，a P ＜ 0. 05。 图 1 不同剂量组胞浆和胞核中Nrf 2 蛋白表达

结果表明，低、中、高剂量组胞浆Nrf 2 蛋白表达水平明显低于对照组(P ＜ 0.05) ，而低、中、高剂量组之间的差异不明显。胞核Nrf 2 蛋白的表达中，高剂量组Nrf 2 蛋白表达水平明显高于对照组 (P ＜ 0.05) ，而低剂量组、中剂量组与对照组之间的差异并不明显。结果提示，铅致SH-SY 5 Y 细胞氧化损伤导致胞浆中Nrf 2 穿核进入胞核，在胞核内积聚进而启动下游氧化应激反应。

图 2

注: 与对照组比较，a P ＜ 0. 05。 图 2 不同剂量组PKC-δ、CKⅡ蛋白的表达水平

结果表明，低、中、高剂量组PKC-δ 蛋白的表达升高，与对照组的差异有统计学意义(P ＜ 0.05) ，而低剂量组、中剂量组与高剂量组之间的差异尚不能认为有统计学意义。CKⅡ蛋白表达中，高剂量组表达水平明显高于对照组(P ＜ 0.05) 。结果提示，铅暴露能激活蛋白激酶PKC-δ 和CKⅡ，导致其表达增加。

结果显示随着暴露铅剂量的增加，细胞中ROS 含量逐渐增加，GSH 含量逐渐减少，细胞氧化损伤逐渐加重。GSH 可以阻止氧化剂对蛋白质分子中巯基的氧化以及清除、减少和抑制自由基的产生，机体内GSH 耗竭会加重外源化学物产生的毒性作用从而增强损伤^{[4, 5]}，故细胞中耗竭的GSH 能加重了 ROS 的氧化损伤。

正常情况下，Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1 (Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1) 作为 Nrf 2 的负调控因子与Nrf 2 结合，同时又与肌动蛋白细胞骨架结合被锚定于胞浆，并驱动Nrf 2 经泛素蛋白酶小体水解。在氧化应激源和外源性有毒物质刺激下，Nrf 2 被激活并与Keap1 解离后进入细胞核，从而启动抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE) 转录和表达^[6]。最近的研究表明Nrf 2 在核内的积聚可能是通过对胞浆中处于不稳定状态的Nrf 2 磷酸化修饰的机制来实现的^{[7, 8]}。本研究发现随着铅剂量的增加，Nrf 2 在核内和核外有量的变化，表现为胞浆中Nrf 2 表达降低以及胞核中 Nrf 2 表达升高，这提示了Nrf 2 的激活并产生了核内转移进而发挥抗氧化反应，而穿核过程也是Nrf 2 发挥其转录因子作用的必要过程。相应地，细胞中蛋白激酶PKC-δ 和CKⅡ蛋白总体上的升高趋势提示Nrf 2 的激活可能与此两种蛋白激酶对其磷酸化有关。

综上所述，铅可致神经细胞的氧化损伤并诱导其产生相关的应激性反应。在氧化损伤的同时，激活相关蛋白激酶PKC-δ、CKⅡ，通过对Nrf 2 磷酸化修饰使其从胞浆解离进入胞核，启动抗氧化应激反应抵抗氧化损伤。